Das Problem der Reaktion des Pdotoplasmas

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    23-Aug-2016

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  • DAS PROBLEM DER REAKTION DES PROTOPLASMAS (Neue experimentelle Studien, ausgefiihrt an Amoeben)

    Von JOSEF SPEK (IIeidelberg) und ROBERT CtIAMBERS (New York) (Aus dem Washington Square College, New-York Univez~ity)

    Eingegangen am 27. Juni 1933

    Die vorliegenden Untersuchungen wurdcn w/~hrend eines liingeren Aufent- haltes yon Prof. Jose f Spek in New-York im Laboratorium von Prof. Rober t Chambers zum groBen Tell in gemeinsamer Arbeit ausgeffihrtZ). Programm und Methoden ergaben sich aus Untersuchungen beider Autoren, welehe in den letzten Jahren fiber dieses und verwandte Gebiete verSffentlicht worden sind.

    Wir beschlossen das Problem der R~aktion der Protoplasmasubstanzen an Hand yon Versuchcn mit Indikatoren an Amoeben wieder in Angriff zu nehmen, well einerseits Publikationen aus der Schule von Chambers (so bes. P. Rezn iko f f und H .Po l lack (1928) und H .Po l lack (1928) in vorlimfiger Form gezeigt batten, dab man an diesem Objekt mit den angewandten Methoden pH-Ph/inomene von prinzipieller Bedeutung demonstrieren kann. Andrerseits hatten Untersuchungen yon J. Spek (s. bes. 1930 und 1933) ergeben, dab man die Versuchsanordnung bei der F~rbung der lebenden Zellen mit Indikatoren viel mehr variieren und auch von anderen Gesichtspunkten betrachten mul3, ehe man einigermal~en bindende Schlfisse bezgl, des pH in der lebenden Zelle ziehen kann. In zahlreichen friiheren Publikationen fiber kolorimetrische pH- Bestimmungen im lebenden Protoplasma hatte eine Analyse dessen, was eigentlich gefi~rbt und beobachtet worden war, gefehIt. Die theoretischen Vorstellungen yon R. Chambers fiber die Reaktion in den lebenden Zellen sind schon in zahireichen Publikationen, die unten zitiert sind, vorgebracht worden. In dieser Abhandlung sollen die Abhandlungen yon J. Spek etwas ausfiihrlicher erSrtert werden, da sie zum Tell iiberhaupt erst im Laufe dieser Untersuchung ge- wonnen worden sind, zum anderen Tell aber in ihr zum erstenmal bei diesem Objekt ihre Anwendung gefunden haben.

    Im Mittelpunkt der Spekschen l~berlegungen stand (lie Schlul3folgerung, zu der ihn seine o. e. Arbeiten geffihrt hatten, dal] es gar nicht ausgemacht ist, dab in einer lebenden Zelle nur ein vSllig ausgeglichenes pH existiert, dab die Kolloidteilchen ihre Eigenreaktion zu haben seheinen, die yon der des Dispersions-

    1) Es ist mir ein Bcdfirfnis, Herrn Prof. R. Chambers fiir die mir in seinem/nstitut erwiesene Gastfrcundschaft zu danken. Im besondern danke ich ihm hcrzlich, dab er reich in seine vorziigliche Zellinjektionstechnik eingeweiht hat. J. Spek.

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    mittels bis zu einem gewissen Gradc abweichen kann, und dai~ offensiehtlich in tin und derselben Zelle - - auf irgendeine Weise voreinander geschfitzt - - Kolloidteilehen verschiedener Reaktion unausgeglichen nebeneinander vor- kommen k6nnen. Spek war zu diesen Vorstellungen durch Befunde an tierischen Eizellen gekommen. Es lag ibm natiirlich viel daran, sic auch an ganz anderem Material zu priifen. So hattcn wir beide an einer nochmaligen (~berpriifung und an einer Weiterfiihrung der pH-Versuche an den Amoeben ein lebhaftcs ]nteresse.

    Unser Hauptob jekt war Amoeba duma, von der im Laboratorium bliihende Kulturen vorhanden waren, die mit Quellwasser von den Great Bear Mountains und ausgekochten Hcuhalmen angesetzt wurden. An Amoeba proteus wurden nur vereinzelte Versuche ausgeffihrt. Kleine Limax-Amoeben wurden wegen einiger iiberraschender Resultate, welche Vitalf~irbungen an ihnen ergeben hattcn, zum Vergleich heraxlgezogen. Bei den groBen Amoeben war unsere I tauptmethode die M ik ro in jekt ion yon Indikatoren in reiner L6sung oder gemischt mit anderen Stoffen. An kleinen Amoeben ist es sehr schwer, Mikro- injektionen auszufiihren, da ihre Membran ~u[~erst z~the ist. Wenn. einzelne Injektionen gelingen, ergibt sich eine neue Schwierigkeit dadurch, (1~13 sich die injizierte Fliissigkeit mit dem Plasma oft nicht mischt, sondern in Form einer Fltissigkeitsblase zwischen Plasma und Membran erhaltcn b le ib t . - Auf~er den Inj ektionen wurden Z e r r e i 13 u n g s - u n d A n s t i c h v e r s u c h e in verschiedener Weise mit dem Hauptversuch kombiniert, und Kontrollen mit Vitalf/~,rbungen ausgefiihrt. Die Injektionen wurden mit der M ik romanipu la tor techn ik Yon Chambers ausgefiihrt, fiber welche frfher ausfiihrlich beriehtet wurde. Die Indikatoren yon C lark und Lubs wurden yon der Firma La Motte (New- York) bezogen.

    Zur Injektion miissen oft konzentricrtere LSsungen der Farbstoffe ver- wendet werden, als sic fiir Rcagenzglasversuche iiblich sind. Kleine lnjektionen yon etwa 0,5 %igen L6sungen der Farbstoffe, die sich dann tiber die ganze Zelle verteilen und ihr eine blasse F~rbung verleihen, haben meist die hiibschesten physiologischen Resultate ergeben. Die so gefarbten Amoeben nehmen sehr bald nach der Injektion ein v611ig normalcs Aussehen an, ffihren lcbhafte Be- wegungen aus und kSnnen auch nach Stunden und Tagen im besten Zustand angetroffen werden. Spezifische Wirkungen der injizierten Stoife sind in unsern Protokollen verzeichnet.

    Abweichend yon der Methode von Rezn iko f f und Po l lack haben wit, wennwi rdenE in i lu l~ yon E lekt ro ly ten aui die Ind ikator reakt ionen des Protoplasmas studieren wollten, g le ich ein Gemisch von dem betr . Ind ikator mi t der Sa lz lSsung oder dergl , injiziert. Das bietet den gro~en Vorteil, dab man den Einflufl der Elektrolyte auf den Indikator selbst immer kontrollieren, das Verhalten be ider Substanzen sogleieh nach ihrem Eintritt in die Zelle studieren kann und eben mit einer Injektion auskommt. Die w~l~rigen LSsungen vieler Salze, welche einen auff~lligen EinfluB auf die Farbe der in die lebenden Zellen injizierten ]ndikatoren ausiiben, haben infolge hydrolytiseher Spaltung eine vom Neutralpunkt mehr oder weniger abweiehende Reaktion.

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    Bei jedem Salz wurden daher kolorimetrischG Bestimmungen. des pI-[ seiner L(Jsungen gcmacht und hierbei auch darauf geachtct, ob sich nicht infolge spezi- fischGr Einflfisse der SalzG auf die Indikatoren bci diGsem oder jenem Indikator AbweichungGn yon dem mit andGrn Indikatoren gGfundenen Werten ergeben. Dieses war jedoch bGi den bier vGrwendeten vGrh/iltnism/il3ig niederen Konzen- trationen nicht zu bcobachten. Wir fanden keinGn Fall, in dem Gine SalzlSsung mit einem der Clarkschen Indikatorcn einG Farbe gegebGn h/~tte, dig vSllig aus der Reihe gefallen ws d. h. mit der mit andern IndikatorGn im Widerspruch gcstanden h/~tte. Bezfiglich der spez. Wirkung der Magnesiumsalze siehe spiiter S. 399. - - Bei nicht neutralen Salzl6sungcn versuchtcn wir durch Zusatz yon NaOH oder HC1 eine Korrektur der Reaktion zu crreichen, oder wir stellten dic Wirkung des Salzcs sowohl bGi saurcr, als auch bei neutraler und alkalischer Reaktion fcst. Einc gro6e Rolle kommt diGsem Punkt bei unsGrer Versuchs- anordnung nicht zu, da, wie wit sehen wGrden, welt st/irkere AnsiiuGrungen oder Alkalisierungen als jenG Salzl6sungen sic jG hervorrufcn k6nnten, an sich den normalGn Farbton der Indikatorcn im Protoplasma nicht zu ver/indern vcrm6gen, und die spezifischen WirkungGn ciniger Kationen yon kleineren Schwankungen der Reaktion ihrer L6sungen weitgehend unahh~.ngig sind.

    Vielfach erwies es sich praktischcr, statt Indikatorl6sungen von einem pH von 7,0 solche in der Farbe ihres Umschlagspunktes zu vGrwenden. Wenn wir das taten, ist es in unsern ProtokollGn verzcichnet.

    Die Reaktion des Au6enmGdiums ist, solange dic Amoeben am Leben sind, ffir UnsGrG Versuche ohne besondere BedGutung, wGil die des Zcllinnern yon ihr unabh~ingig ist. Stirbt eine Zelle ab, so kann nach Giniger Zeit - - meist nicht vor einGr Vicrtelstmlde - - alkalisches Ku]turmedium alkalischc F~rbung der injizierten Indikatoren hervorrufen. Bald darauf wird dann schlic61ich der ganze Farbstoff aus der Zelleiehe ausgewaschen.

    Vicle Injektionen von kSrperfremdGn Substanzen haben leider zur Folge, dab sich an den AmoebGn das Gebiet um die InjGktionsstelle hGrum plStzlich fiber die Oberfliiehe vorwSlbt, s ich in Form e iner Kuge l yon dem t ibr igen Ze l lkSrper abschnf i r t und in wenigGn Minuten abstirbt. Chambers hat den Vorgang am typischen Beispiel der KaIzium-Wirkung ausfiihrlich beschriGben (1926). Dieser , ,p inch ing o f f " -P roze / ] ist natfirlich eine unerwfinschte Komplikation der Bcobachtung der Substanzwirkungcn. Aber glficklichcrwGise treten viele Reaktionen der injizier~n Substanzcn so rasch ein, da|~ sic schon vor der Abschniirung vollzogen sind, und andrerseits kommt yon den injizicrten Stoffen, wig man etwa bei den Farben an der FKrbung erkennen kann, (fit noch genug auch in den Teil der Amoebe hineia, wGlcher am Leber~ blcibt. Wenn Gine Abschnfirung eintrat, ist das in unsern Protokollen verzeichnet, und wit haben dann stets gesonderte BGfunde gemacht fiber das Verhalten der Amoeben vor Beginn der Abschnfirung, die Ver/~,ndcrungen in der abgeschnfirten Kugel und in dcm am Leben bleibenden Teil der Zelle.

    Die meistGn Versuchc wurden erst nach zahlreichen wohlgehmgenen Irr- jektionen protokolliert und die Hauptversuchc yon den verschiedensten Gesichts- punkten immer wiedcr wiedcrholt.

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    1. Die mit den Indikatoren yon Clark und Lubs erhaltenen Farbreaktionen des normalen Protoplasmas

    Injiziert wurden kleine bis betr~tchtliche Mengen yon 0,2--1 ~ igen LSsungen yon 1. Brorapheno lb lau , 2. Brorakreso lgr f in , 3. Methy l ro t (schwach alkoholisch), 4. Ch lo rpheno l ro t , 5. B romkreso lpurpur , 6. Brorathymol - b lau, 7. Pheno l ro t und 8. K reso l ro t . Die nach Injektion beobachteten Farben waren - - in alien Versuchen vSllig iibereinstimmend die folgenden:

    Tabe l le l $

    1. 2. 3. 4. I 5. 6. 7. 1 8 . BPB BCG MR CPR BCP BTB PR I CR x)

    tier blauviolett blau tiefgelb Ikarminroti blauviolett griinlichblau! ziegelr6t blaBgelb i i

    Zu dicsen Daten sind manclmrlei Erl~uterungen notwendig. So si~ld sie z. B. dadurch ungleichwertig, dab die Toxizit~t der verschicdenen Farbstoffe sehr verschieden ist. Am geringsten ist die Toxizit~it vorl CPR und PR. In diesen Farben erfolgen auch nur vereinzelte Abschniirungen un(1 die gefi~rbten Tiere zeigen normale Bewegung und vSllig norraales Aussehen. In BCP tritt regel- ra~13ig Abschniirung einer Kugel ein. Der Rest b]eibt aber am Leben und ist ganz norraal. In BCG und MR wcrden die Tiere racist bewegungslos. Am giftigstcn ist BPB und BTB, welche die Tiere immer tSten. (Nach Erfahrungen yon Spek scheint diese hohe Toxizit~t dera BTB yon E. Merck nicht zuzukommen.) Eines besonderen Kommentars bedarf dann das mit Brorathymolb lau er- haltene F~rbungsbild. Es tritt uns n~mlich nach Injektionen von BTB zum crsten Malt die Erscheinung entgegen, (lal~ zwei d i f fe rcnte Koraponentcn des Amoebenp lasmas nicht nur eine quantitativ verschicdene Affinit~t zu be- stiraraten Farben zeigen, sondern wenn sic sich beide anf~rben, in Indikatoren auch einen sehr versch iedenen Farbton annehmen kSnnen. Die eine dieser Plasmakomponenten ist das le icht f l i i ss ige k lare Hya lop lasma, welches bekanntlich bei der Entstehung neuer Pseudopodien zuerst oft allcin vorflieBt. Die zweiteKomponente sind die ga l le r t igen Hfi l len der fe inen B l~schen 2) des Protoplasmas, die offenbar sehr wechselnde Beschaffenheit annehraen k6nnen, so dal~ die Blaschen bald alle zu einer zusammenh~ngenden, mehr oder weniger zentralen Masse verpappen, bald sich alle auseinanderlSsen und sich im Hyalo-

    1) Wir werden aueh im Text, woes nieht miflverstandlich ist, vielfaeh dicsc schon yon Clark in scinem Buch eingeftihr~n Abkiirzungen fiir die Namcn der Indikatorcn be- ntitzen.

    ~) DaB es sich bei diescn wie Granula ausschenden Gebilden der Amocben und vielcr andcrcr Protozoon in Wirklichkeit um Bl~tschcn mit eincm wi~flrigen Inhalt handelt, die abcr cinc viskosc, mehr oder weniger dicke gallertartigc Hiillc besitzen, hat Spek (1924) gezeigt. Sie sehen, .wenn sie klein sind, eben wcgcrt ihrer dichtcn Hiillen in der Tat wie Kiigelchen aus einer dichteren Substanz aus. Zwisehen ihncn k6nnen bei kleinen Amoeben echte, stark lichtbrechende Granulen vorkommen.

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    plasma frei aneinander vorbeibewegen k6nnen. Die Substanz dieser Hfillen der B1/~schen ist es, welehe bei zahlreichen Versuchen ein anderes fi~rberisehes Verhalten zeigte. Wir wollen ihr daher einen besonderen Namen geben und sie ,, Granu lop lasma" nennen.

    Am sch6nsten kann man die besondere Natur der Plasmahtillen der B1/ischen dadurch demonstrieren, dab sie sieh bei manchen Amoeben elektiv vital fiirben lassen. Eine solche V i ta l f~rbung des gesamten GranulopIasmas gelang bci Amoeba polypodia. Nattirlich lassen sich die Verh~ltnisse bei dieser Art nieht so ohne weiteres auf die grol3en Amocben iibertragen, bei denen sich mit den gleichen Vitalfarbstoffen nur der Inhalt der verschiedenen Vakuolen anfiirben l'~13t, s wir haben keinen Grund an der prinzipiellen t3bereinstimmung der Strukturelemente der grof~en und der kleinen Amoeben zu zweifeln. ])as Granulopla,~ma der Amoeba polypodia f/~rbt sich in N e u t r a I r o t, B r i 11 a n ~ vi t a 1- ro t und Br i l l antkresy lv io le t t rasch und stark an. Das iibrige Plasma bleibt ungef/irbt. Die Vitalitiit der Amoeben bleibt dureh die Farbung v611ig unbeein- tr/tchtigt. Alle drei Farben sind Indikatoren (bezgl. der Indikatoreigenschaften von Brillantkresvlviolett siehe Spek, ] 933) und al le (trei f/~rben d as G ranu lo - p lasma in t ie fsaurem Farbton : Neutralrot violcttrosa, Brillantvitalrot satt- rosa und Brillantkresylviolett himmelblau. Nach der Vitalrotf/irbung entspricht das einer Azidititt yon mindestens 5,8; bei der Neutralrotfi~rbung tritt der Stieh ins Violette wohl nur durch die starke Speicherung des Farbstoffes viel st/irker hervor als in sehr verdiinnten L6sungen des Farbstoffes yon einem pH zwisehen 5 und 6. Jedenfalls aber ist dieser Farbton bei neutraler oder alkalischer Reaktion ganz undenkbar. Das Hyaloplmsma der kleinen Amoeben f/~rbt sich mit BCP tier blauviolett.

    Ob das Hvaloplasma eine einheit]iche Substanz ist, ist von vornherein sehr fraglich. Mit der Aufstellung des Namens soil das aueh nicht behauptet werden. Auch die Resultate einiger F~rbungen sprachen dafiir, dal3 im Hyalo- plasma versehiedene Substanzen vorhanden sein m/issen. Da abet eine Trennung nicht m6glich war, lassen wir dic Frage often. Die starke Ver- ~nderlichkeit des Granuloplasmas, das Verpappen und SichauseinanderlSsen der ,,Granulen" kann man sich kaum ohne kolloidehemische Zustands~nderungen der Granuloplasmasubstanz vorstellen, bei denen ein Teil derselben in LSsung gehen und so auch ins Hyaloplasma gelangen k6nnte (Spek). Auch hieraus er- gibt sich, dab eine allzu scharfe Unterscheidung unangebracht witre.

    Die in der Tabelle angegebenen Farben beziehen sieh alle auf das Hyalo- plasma. Wenn hyaline Pseudopodien neuge...