Das Problem der Reaktion des Pdotoplasmas

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    23-Aug-2016

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  • DAS PROBLEM DER REAKTION DES PROTOPLASMAS (Neue experimentelle Studien, ausgefiihrt an Amoeben)

    Von JOSEF SPEK (IIeidelberg) und ROBERT CtIAMBERS (New York) (Aus dem Washington Square College, New-York Univez~ity)

    Eingegangen am 27. Juni 1933

    Die vorliegenden Untersuchungen wurdcn w/~hrend eines liingeren Aufent- haltes yon Prof. Jose f Spek in New-York im Laboratorium von Prof. Rober t Chambers zum groBen Tell in gemeinsamer Arbeit ausgeffihrtZ). Programm und Methoden ergaben sich aus Untersuchungen beider Autoren, welehe in den letzten Jahren fiber dieses und verwandte Gebiete verSffentlicht worden sind.

    Wir beschlossen das Problem der R~aktion der Protoplasmasubstanzen an Hand yon Versuchcn mit Indikatoren an Amoeben wieder in Angriff zu nehmen, well einerseits Publikationen aus der Schule von Chambers (so bes. P. Rezn iko f f und H .Po l lack (1928) und H .Po l lack (1928) in vorlimfiger Form gezeigt batten, dab man an diesem Objekt mit den angewandten Methoden pH-Ph/inomene von prinzipieller Bedeutung demonstrieren kann. Andrerseits hatten Untersuchungen yon J. Spek (s. bes. 1930 und 1933) ergeben, dab man die Versuchsanordnung bei der F~rbung der lebenden Zellen mit Indikatoren viel mehr variieren und auch von anderen Gesichtspunkten betrachten mul3, ehe man einigermal~en bindende Schlfisse bezgl, des pH in der lebenden Zelle ziehen kann. In zahlreichen friiheren Publikationen fiber kolorimetrische pH- Bestimmungen im lebenden Protoplasma hatte eine Analyse dessen, was eigentlich gefi~rbt und beobachtet worden war, gefehIt. Die theoretischen Vorstellungen yon R. Chambers fiber die Reaktion in den lebenden Zellen sind schon in zahireichen Publikationen, die unten zitiert sind, vorgebracht worden. In dieser Abhandlung sollen die Abhandlungen yon J. Spek etwas ausfiihrlicher erSrtert werden, da sie zum Tell iiberhaupt erst im Laufe dieser Untersuchung ge- wonnen worden sind, zum anderen Tell aber in ihr zum erstenmal bei diesem Objekt ihre Anwendung gefunden haben.

    Im Mittelpunkt der Spekschen l~berlegungen stand (lie Schlul3folgerung, zu der ihn seine o. e. Arbeiten geffihrt hatten, dal] es gar nicht ausgemacht ist, dab in einer lebenden Zelle nur ein vSllig ausgeglichenes pH existiert, dab die Kolloidteilchen ihre Eigenreaktion zu haben seheinen, die yon der des Dispersions-

    1) Es ist mir ein Bcdfirfnis, Herrn Prof. R. Chambers fiir die mir in seinem/nstitut erwiesene Gastfrcundschaft zu danken. Im besondern danke ich ihm hcrzlich, dab er reich in seine vorziigliche Zellinjektionstechnik eingeweiht hat. J. Spek.

  • Das Problem dcr Reaktion des Protoplasma.~ 377

    mittels bis zu einem gewissen Gradc abweichen kann, und dai~ offensiehtlich in tin und derselben Zelle - - auf irgendeine Weise voreinander geschfitzt - - Kolloidteilehen verschiedener Reaktion unausgeglichen nebeneinander vor- kommen k6nnen. Spek war zu diesen Vorstellungen durch Befunde an tierischen Eizellen gekommen. Es lag ibm natiirlich viel daran, sic auch an ganz anderem Material zu priifen. So hattcn wir beide an einer nochmaligen (~berpriifung und an einer Weiterfiihrung der pH-Versuche an den Amoeben ein lebhaftcs ]nteresse.

    Unser Hauptob jekt war Amoeba duma, von der im Laboratorium bliihende Kulturen vorhanden waren, die mit Quellwasser von den Great Bear Mountains und ausgekochten Hcuhalmen angesetzt wurden. An Amoeba proteus wurden nur vereinzelte Versuche ausgeffihrt. Kleine Limax-Amoeben wurden wegen einiger iiberraschender Resultate, welche Vitalf~irbungen an ihnen ergeben hattcn, zum Vergleich heraxlgezogen. Bei den groBen Amoeben war unsere I tauptmethode die M ik ro in jekt ion yon Indikatoren in reiner L6sung oder gemischt mit anderen Stoffen. An kleinen Amoeben ist es sehr schwer, Mikro- injektionen auszufiihren, da ihre Membran ~u[~erst z~the ist. Wenn. einzelne Injektionen gelingen, ergibt sich eine neue Schwierigkeit dadurch, (1~13 sich die injizierte Fliissigkeit mit dem Plasma oft nicht mischt, sondern in Form einer Fltissigkeitsblase zwischen Plasma und Membran erhaltcn b le ib t . - Auf~er den Inj ektionen wurden Z e r r e i 13 u n g s - u n d A n s t i c h v e r s u c h e in verschiedener Weise mit dem Hauptversuch kombiniert, und Kontrollen mit Vitalf/~,rbungen ausgefiihrt. Die Injektionen wurden mit der M ik romanipu la tor techn ik Yon Chambers ausgefiihrt, fiber welche frfher ausfiihrlich beriehtet wurde. Die Indikatoren yon C lark und Lubs wurden yon der Firma La Motte (New- York) bezogen.

    Zur Injektion miissen oft konzentricrtere LSsungen der Farbstoffe ver- wendet werden, als sic fiir Rcagenzglasversuche iiblich sind. Kleine lnjektionen yon etwa 0,5 %igen L6sungen der Farbstoffe, die sich dann tiber die ganze Zelle verteilen und ihr eine blasse F~rbung verleihen, haben meist die hiibschesten physiologischen Resultate ergeben. Die so gefarbten Amoeben nehmen sehr bald nach der Injektion ein v611ig normalcs Aussehen an, ffihren lcbhafte Be- wegungen aus und kSnnen auch nach Stunden und Tagen im besten Zustand angetroffen werden. Spezifische Wirkungen der injizierten Stoife sind in unsern Protokollen verzeichnet.

    Abweichend yon der Methode von Rezn iko f f und Po l lack haben wit, wennwi rdenE in i lu l~ yon E lekt ro ly ten aui die Ind ikator reakt ionen des Protoplasmas studieren wollten, g le ich ein Gemisch von dem betr . Ind ikator mi t der Sa lz lSsung oder dergl , injiziert. Das bietet den gro~en Vorteil, dab man den Einflufl der Elektrolyte auf den Indikator selbst immer kontrollieren, das Verhalten be ider Substanzen sogleieh nach ihrem Eintritt in die Zelle studieren kann und eben mit einer Injektion auskommt. Die w~l~rigen LSsungen vieler Salze, welche einen auff~lligen EinfluB auf die Farbe der in die lebenden Zellen injizierten ]ndikatoren ausiiben, haben infolge hydrolytiseher Spaltung eine vom Neutralpunkt mehr oder weniger abweiehende Reaktion.

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    Bei jedem Salz wurden daher kolorimetrischG Bestimmungen. des pI-[ seiner L(Jsungen gcmacht und hierbei auch darauf geachtct, ob sich nicht infolge spezi- fischGr Einflfisse der SalzG auf die Indikatoren bci diGsem oder jenem Indikator AbweichungGn yon dem mit andGrn Indikatoren gGfundenen Werten ergeben. Dieses war jedoch bGi den bier vGrwendeten vGrh/iltnism/il3ig niederen Konzen- trationen nicht zu bcobachten. Wir fanden keinGn Fall, in dem Gine SalzlSsung mit einem der Clarkschen Indikatorcn einG Farbe gegebGn h/~tte, dig vSllig aus der Reihe gefallen ws d. h. mit der mit andern IndikatorGn im Widerspruch gcstanden h/~tte. Bezfiglich der spez. Wirkung der Magnesiumsalze siehe spiiter S. 399. - - Bei nicht neutralen Salzl6sungcn versuchtcn wir durch Zusatz yon NaOH oder HC1 eine Korrektur der Reaktion zu crreichen, oder wir stellten dic Wirkung des Salzcs sowohl bGi saurcr, als auch bei neutraler und alkalischer Reaktion fcst. Einc gro6e Rolle kommt diGsem Punkt bei unsGrer Versuchs- anordnung nicht zu, da, wie wit sehen wGrden, welt st/irkere AnsiiuGrungen oder Alkalisierungen als jenG Salzl6sungen sic jG hervorrufcn k6nnten, an sich den normalGn Farbton der Indikatorcn im Protoplasma nicht zu ver/indern vcrm6gen, und die spezifischen WirkungGn ciniger Kationen yon kleineren Schwankungen der Reaktion ihrer L6sungen weitgehend unahh~.ngig sind.

    Vielfach erwies es sich praktischcr, statt Indikatorl6sungen von einem pH von 7,0 solche in der Farbe ihres Umschlagspunktes zu vGrwenden. Wenn wir das taten, ist es in unsern ProtokollGn verzcichnet.

    Die Reaktion des Au6enmGdiums ist, solange dic Amoeben am Leben sind, ffir UnsGrG Versuche ohne besondere BedGutung, wGil die des Zcllinnern yon ihr unabh~ingig ist. Stirbt eine Zelle ab, so kann nach Giniger Zeit - - meist nicht vor einGr Vicrtelstmlde - - alkalisches Ku]turmedium alkalischc F~rbung der injizierten Indikatoren hervorrufen. Bald darauf wird dann schlic61ich der ganze Farbstoff aus der Zelleiehe ausgewaschen.

    Vicle Injektionen von kSrperfremdGn Substanzen haben leider zur Folge, dab sich an den AmoebGn das Gebiet um die InjGktionsstelle hGrum plStzlich fiber die Oberfliiehe vorwSlbt, s ich in Form e iner Kuge l yon dem t ibr igen Ze l lkSrper abschnf i r t und in wenigGn Minuten abstirbt. Chambers hat den Vorgang am typischen Beispiel der KaIzium-Wirkung ausfiihrlich beschriGben (1926). Dieser , ,p inch ing o f f " -P roze / ] ist natfirlich eine unerwfinschte Komplikation der Bcobachtung der Substanzwirkungcn. Aber glficklichcrwGise treten viele Reaktionen der injizier~n Substanzcn so rasch ein, da|~ sic schon vor der Abschniirung vollzogen sind, und andrerseits kommt yon den injizicrten Stoffen, wig man etwa bei den Farben an der FKrbung erkennen kann, (fit noch genug auch in den Teil der Amoebe hineia, wGlcher am Leber~ blcibt. Wenn Gine Abschnfirung eintrat, ist das in unsern Protokollen verzeichnet, und wit haben dann stets gesonderte BGfunde gemacht fiber das Verhalten der Amoeben vor Beginn der Abschnfirung, die Ver/~,ndcrungen in der abgeschnfirten Kugel und in dcm am Leben bleibenden Teil der Zelle.

    Die meistGn Versuchc wurden erst nach zahlreichen wohlgehmgenen Irr- jektionen protokolliert und die Hauptversuchc yon den verschiedensten Gesichts- punkten immer wiedcr wiedcrholt.

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    1. Die mit den Indikatoren yon Clark und Lubs erhaltenen Farbreaktionen des normalen Protoplasmas

    Injiziert wurden kleine bis betr~tchtliche Mengen yon 0,2--1 ~ igen LSsungen yon 1. Brorapheno lb lau , 2. Brorakreso lgr f in , 3. Methy l ro t (schwach alkoholisch), 4. Ch lo rpheno l ro t , 5. B romkreso lpurpur , 6. Brorathymol - b lau, 7. Pheno l ro t und 8. K reso l ro t . Die nach Injektion beobachteten Farben waren - - in alien Versuchen vSllig iibereinstimmend die folgenden:

    Tabe l le l $

    1. 2. 3. 4. I 5. 6. 7. 1 8 . BPB BCG MR CPR BCP BTB PR I CR x)

    tier blauviolett blau tiefgelb Ikarminroti blauviolett griinlichblau! ziegelr6t blaBgelb i i

    Zu dicsen Daten sind manclmrlei Erl~uterungen notwendig. So si~ld sie z. B. dadurch ungleichwertig, dab die Toxizit~t der verschicdenen Farbstoffe sehr verschieden ist. Am geringsten ist die Toxizit~it vorl CPR und PR. In diesen Farben erfolgen auch nur vereinzelte Abschniirungen un(1 die gefi~rbten Tiere zeigen normale Bewegung und vSllig norraales Aussehen. In BCP tritt regel- ra~13ig Abschniirung einer Kugel ein. Der Rest b]eibt aber am Leben und ist ganz norraal. In BCG und MR wcrden die Tiere racist bewegungslos. Am giftigstcn ist BPB und BTB, welche die Tiere immer tSten. (Nach Erfahrungen yon Spek scheint diese hohe Toxizit~t dera BTB yon E. Merck nicht zuzukommen.) Eines besonderen Kommentars bedarf dann das mit Brorathymolb lau er- haltene F~rbungsbild. Es tritt uns n~mlich nach Injektionen von BTB zum crsten Malt die Erscheinung entgegen, (lal~ zwei d i f fe rcnte Koraponentcn des Amoebenp lasmas nicht nur eine quantitativ verschicdene Affinit~t zu be- stiraraten Farben zeigen, sondern wenn sic sich beide anf~rben, in Indikatoren auch einen sehr versch iedenen Farbton annehmen kSnnen. Die eine dieser Plasmakomponenten ist das le icht f l i i ss ige k lare Hya lop lasma, welches bekanntlich bei der Entstehung neuer Pseudopodien zuerst oft allcin vorflieBt. Die zweiteKomponente sind die ga l le r t igen Hfi l len der fe inen B l~schen 2) des Protoplasmas, die offenbar sehr wechselnde Beschaffenheit annehraen k6nnen, so dal~ die Blaschen bald alle zu einer zusammenh~ngenden, mehr oder weniger zentralen Masse verpappen, bald sich alle auseinanderlSsen und sich im Hyalo-

    1) Wir werden aueh im Text, woes nieht miflverstandlich ist, vielfaeh dicsc schon yon Clark in scinem Buch eingeftihr~n Abkiirzungen fiir die Namcn der Indikatorcn be- ntitzen.

    ~) DaB es sich bei diescn wie Granula ausschenden Gebilden der Amocben und vielcr andcrcr Protozoon in Wirklichkeit um Bl~tschcn mit eincm wi~flrigen Inhalt handelt, die abcr cinc viskosc, mehr oder weniger dicke gallertartigc Hiillc besitzen, hat Spek (1924) gezeigt. Sie sehen, .wenn sie klein sind, eben wcgcrt ihrer dichtcn Hiillen in der Tat wie Kiigelchen aus einer dichteren Substanz aus. Zwisehen ihncn k6nnen bei kleinen Amoeben echte, stark lichtbrechende Granulen vorkommen.

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    plasma frei aneinander vorbeibewegen k6nnen. Die Substanz dieser Hfillen der B1/~schen ist es, welehe bei zahlreichen Versuchen ein anderes fi~rberisehes Verhalten zeigte. Wir wollen ihr daher einen besonderen Namen geben und sie ,, Granu lop lasma" nennen.

    Am sch6nsten kann man die besondere Natur der Plasmahtillen der B1/ischen dadurch demonstrieren, dab sie sieh bei manchen Amoeben elektiv vital fiirben lassen. Eine solche V i ta l f~rbung des gesamten GranulopIasmas gelang bci Amoeba polypodia. Nattirlich lassen sich die Verh~ltnisse bei dieser Art nieht so ohne weiteres auf die grol3en Amocben iibertragen, bei denen sich mit den gleichen Vitalfarbstoffen nur der Inhalt der verschiedenen Vakuolen anfiirben l'~13t, s wir haben keinen Grund an der prinzipiellen t3bereinstimmung der Strukturelemente der grof~en und der kleinen Amoeben zu zweifeln. ])as Granulopla,~ma der Amoeba polypodia f/~rbt sich in N e u t r a I r o t, B r i 11 a n ~ vi t a 1- ro t und Br i l l antkresy lv io le t t rasch und stark an. Das iibrige Plasma bleibt ungef/irbt. Die Vitalitiit der Amoeben bleibt dureh die Farbung v611ig unbeein- tr/tchtigt. Alle drei Farben sind Indikatoren (bezgl. der Indikatoreigenschaften von Brillantkresvlviolett siehe Spek, ] 933) und al le (trei f/~rben d as G ranu lo - p lasma in t ie fsaurem Farbton : Neutralrot violcttrosa, Brillantvitalrot satt- rosa und Brillantkresylviolett himmelblau. Nach der Vitalrotf/irbung entspricht das einer Azidititt yon mindestens 5,8; bei der Neutralrotfi~rbung tritt der Stieh ins Violette wohl nur durch die starke Speicherung des Farbstoffes viel st/irker hervor als in sehr verdiinnten L6sungen des Farbstoffes yon einem pH zwisehen 5 und 6. Jedenfalls aber ist dieser Farbton bei neutraler oder alkalischer Reaktion ganz undenkbar. Das Hyaloplmsma der kleinen Amoeben f/~rbt sich mit BCP tier blauviolett.

    Ob das Hvaloplasma eine einheit]iche Substanz ist, ist von vornherein sehr fraglich. Mit der Aufstellung des Namens soil das aueh nicht behauptet werden. Auch die Resultate einiger F~rbungen sprachen dafiir, dal3 im Hyalo- plasma versehiedene Substanzen vorhanden sein m/issen. Da abet eine Trennung nicht m6glich war, lassen wir dic Frage often. Die starke Ver- ~nderlichkeit des Granuloplasmas, das Verpappen und SichauseinanderlSsen der ,,Granulen" kann man sich kaum ohne kolloidehemische Zustands~nderungen der Granuloplasmasubstanz vorstellen, bei denen ein Teil derselben in LSsung gehen und so auch ins Hyaloplasma gelangen k6nnte (Spek). Auch hieraus er- gibt sich, dab eine allzu scharfe Unterscheidung unangebracht witre.

    Die in der Tabelle angegebenen Farben beziehen sieh alle auf das Hyalo- plasma. Wenn hyaline Pseudopodien neugebildet wurden, waren sie stets in den angegebenen Farben gef/~rbt. Ob das Granuloplasma bier in der gleiehen Farbe gefiirbt war und ob es iiberhaupt gef/~rbt war, liel3 sich bei st/irkerer An- f~rbung des Hvaloplasmas in vielen F/tHen nicht entscheiden, da ja die Granulen allseits von Hvaloplasma umgeben sind. Das Ityaloplasma ist das Auf- sehwemmungsmittel der Granulen.

    Bei den Injektionen mit BTB lie8 sieh ohne Ausnahme beobaehten, dab die Farbe der IndikatorlSsung gleichgfiltig, ob er in gelber (saurer) oder blauer (alkalischer) Modifikation injiziert wurde, zuerst einen diffusen gr i in l ieh-

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    b lauen Farbton annahm. Nach wenigen Sekunden ging dann aber der Farb- stoff fast vollst/indig in die Masse des Granuloplasmas fiber, die sich aul3er- ordentlich stark f/i, rbt. Sie nimmt z i t ronenge lbe Farbe an. Da aber hierbei stets auch eine gewisse Koagulation des Granuloplasmas erfolgt und die Amoebe get6tet wird, somit also die F~rbung nicht mehr physiologisch bleibt, wollen wir auf sie erst spitter wieder zurfickkommen und hier vorl/~ufig nur das ver- schiedene f~rberische Verhalten yon Hyaloplasma und Granu[oplasma fest- halten.

    Vergleicht man nun alle die in Tabelle 1 zusammcngestellten Farben, welche die Indikatoren im Amoebenplasma annehmen, so ergibt sich, wenn wir jetzt zuniichst vom besonderen Zustand des Granuloplasmas ai_)sehen, dab die Plasmakomponente, welche diese Ausschl~tge verurs~cht, ein pH haben mul3, welches fiber dem Neutralpunkt - - d. i. der Umschlagspunkt des BTB -- , und andrerseits unter 7,6 liegen mul3, denn Kresolrot bleibt ja rein gelb. Eine sorg- f~ltige Prfifung des Farbtons der Phenolrotf~rbung und ein Vergleich mit der Phenolrotf~rbung yon Pufferreihen und den Clarksehen Tabellen fiihrte uns zum Sehlul3, dab dem Hyaloplazma unserer Amoeben ein pH, von 7,2--7,3 (eher abet 7,3) zukam. Dieser Weft kSnnte aueh mit der ersten Bromthymol- blaufarbe gut fibereinstimmen. Ganz genau stimmte der Farbton der zahllosen mit Phenolrot injizierten Amoeben nicht fiberein, doch zeigten sic stets einen Farbton, der ganz nahe bei dieser pH-Region lag und immer schon einen Stich ins RSCliche hatte. Dieser Wert yon 7,3 ist hSher als der frfiher yon Chambers (1928) und yon P. Rezn iko f f und H. Po l lack (1928) gefundene. Dieser Unter- schied erkl~rt sieh wahrscheinlieh so, dal3 sich bei manchem Amoeben-Material das Granuloplasma mit Phenolrot aueh ein biBchen anf~rbt und dann stets gelbliche Farbe annimmt. Bei den frfiheren Untersuchungen ist auf das differente Verhalten der Plasmakomponenten nicht geachtet worden. W~hrend des ganzen Winters 1932/33 zeigten unsere Amoeben gegen Phenolrot gleiches Verhalten, d. h. immer wieder die beschriebene blal3-ziegelrote Fiirbung, die wahrscheinlieh auf das Hyaloplasma beschri~nkt ist. Als es aber dann im Frfihjahr anfing warm zu werden, stellten wir an den Tieren einer Kultur unzweifelhaft eine gewisse gelbe Anf~rbung des Granuloplasmas fest, durch die sich dann das Gesamthild der F~trbung etwas verschiebt. Ein iihnliches F~rbungsbild mit Phenolrot kann man leicht auch experimentell erzeugcn, dadurch, dab man mit dem Phenolrot etwas CaC12 mitinjiziert (s. S. 398). Schon sehr geringa CaC12-Zus~tze, welche die Zelle nicht sch/~digen, genfigen hierzu. Es ist sehr wohl denkbar, dal] ein erbShter Ca-Gehatt des Mediums diesen Effekt auch hervorruft.

    Bemerkenswert ist, (tab Cohen, Chambers und Rezn iko f f (1928) bei ihren Versuchen mit rH-tndikatoren, die z. T. auch pH-Indikatoren sind, mit o -Ch lorpheno l - Indopheno l eine flfichtige Purpurrotf~trbung der injizierten Amoeben beobachteten, die nur bei einem pH unter 7,0 erscheinen kann. Denn dieser Indikator ist im oxydierten Zustand nur bei alkalischer Reaktion tiefblau. Er wird unterhalb pH = 7,0 purpurn und dann bei h6herer Azidititt rot. Wir zogen ihn auch jetzt zur Erg~nzung unserer Reihe heran und erhielten ausnahmslos eine re inb laue F~rbung des Protoplasmas, die bei kleinen Injektionen sehr

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    bald durch Reduktion des Farbstoffs verschwand, bei st~rkeren hingegcn lange crhalten blieb. Eine Kontrolle des Umschlagspunktes der yon uns injizierten Farbl6sung crgab, (ta~ die purpurne Farbe bei pH ---: 7,0 erschien (Spek).

    Andrerseits ist die Hyaloplasmaf~rbung unserer Phenolrot-Amoeben mit Sicherheit weniger rosa als eincm pH yon 7,6 entsprechen wfirde, dem Weft, den J. Needham und D. Needham (1925) fanden. Zu dieser Bestimmung hat sich Chambers schon 1927 ge~uBert.

    All (tie vitalfi~rbenden indikatoren, welehe Spek an andern Objekten mit Erfolg anwandte, niitzen uns hier nichts, da sie weder das Hyalo- noch das Granuloplasma der gro6en Amoeben anfgrben, sondern sich fast ausschlieBlich in Vakuolen ausscheiden. Sic k6nnen aber auch nicht injiziert werden, da ihre L6sungen bei Berfihrung mit dem Plasma sofort ausgefiillt werden (s. sp~iter S. 403).

    Auch (tie nichttoxischcn Clarkschcn ]ndikatoren, welche in die Amoeben injiziert eine diffuse Plasmafiirbung ergeben, blciben nicht lange Zeit in dieser Weise in dcr Zelle verteilt, sondern scheiden sich wie die erwKhnten vitalfiirbendcn Indikatoren schon nach etwa eincr Stunde in Form yon Vakuolen im Protoplasrna aus. Es mul~ sich um eine Neubildung yon Farbvakuolen handeln und nicht lediglieh um eine Anreicherung in schon vorhandenen Vakuolcn. Denn macht man eine kombinierte Vitalffirbung etwa mit einem roten Farbstoff wie Brillant- vitalrot und in die gleichen Amoeben Injektionen etwa yon einem violettcn Farbstoff wie BCP, so entstehen in allen Amoeben rein rote, neben reinvioletten Vakuolen, also wie es scheint reine Brillantvitalrot-, neben reinen BCP-Vakuolen. Und wenu in eincr Amoebc gr6Berc Cytoplasmavakuolen mit dem normalen w~6rigcn Inhalt schon vorhanden waren, so bleiben dicse vSllig ungcf~rbt.

    V()~ Interesse ist yon diescn Dingen bier fiir uns, da6 die zur Ausscheidung kommenden Farbvakuolen stets eine alkalische Fliissigkeit yon einem pit yon 7,6 oder mehr enthalten. Phenolrot wird darin rein rot, Brillantvitalrot ziegelrot- rostgelb, Brillantkresylviolett blauviolctt. Allc tiefer umschlagenden Indikatoren zeigcn dementsprechend auch den alkalischen Farbton. Die alkalisehe Reaktion der Vakuolen ist yon ihrem ersten Sichtbarwerden an vorhanden (s. S. 403). Wird aber einc Substanz yon dieser Alkalinit'~t aus dem Plasma entmischt, so muI3 sic wohl im Plasma auch vorhanden gewesen sein. MSglicherwcise ist also der Farbton des Hyaloplasmas ein Mischton aus der Farbe ciner alkalischeren und einer saureren Substanz, yon denen dann, wie das bei Entmischungen h~iufig der Fall ist, c ine in grSBerer Menge in die Vakuolcn gelangt.

    Bei unsern Versuchen haben wir stets auch die Farbe des Zellkcrnes nach Injektion der Amoeben mit einem Indikator zu Protokoll genommen. Eine An- fiirbung des Zellkernes erfolgt schon, wenn man die Farbl6sung einfach in den ZellkSrper injiziert, vom Protoplasma aus. Eine direkte Injektion der Zell- kerne der Amoeben diirfte technisch undurchffihrbar sein. Es ergaben sich nach Injektion der reinen Farbl6sungen folgende Farbt6ne der Kerne:

  • Das Problem der Reaktion des Protoplasmas 383

    Tabe l le 2

    BPB l BCG MR CPR BCP BTB PR CR

    ro t - - tief blau- blau ] orange karmi blau- gelb ? " farblos oder violett [ violett sehr blab gelb

    Auch diese Daten sind wie (lie der Tab. 1 insofern ungleichwertig, als einige Farbstoffe, wie BPB und BCG, vielleieht auch MR die Zellen abt6ten, andere nicht. Die Bromphenolblauf/irbung der Kerne bleibt aueh nach v611iger Entf/irbung des Plasmas der toten Zelle noch auff/illig lange erhalten. Die Kern- f/irbung in CPR und BCP haben wir immer wiedcr aueh in lebenden, lebhaft str6menden Zellen beobachtet. Die Anf/irbung der Kerne nach Injektion dieser Farbstoffe erfolgt sehr rasch, die Ffi.rbungen verblassen aber bald sehr stark. In PR ist die Kernf/irbung so blaB, dab man nieht mit Sicherheit sagen kann, ob kS ein sehr blasses Gelb oder Orange ist. Vergl. hiermit den Befund yon S. 386. Die gelbe F/irbung der Kerne in BTB wird uns erst nach den Ausfiihrungen von S. 386 versts werden.

    Sticht man eine mit Chlorphenolrot, Bromkresolpurpur oder Phenolrot injizierte lebende Amoebe an, und l/iBt das Plasma in das Kulturmedium 1) ausflieBen, so verliert es seine Farbe in wenigen Sekunden voUst'J, ndig. Da,u Kulturmedium macht also eine sehon vorhandene F~trbung rfickg/~ngig.

    Sehr lehrreich sind die Rcsultate yon Anst i chversuchen, bei denen wir dem AuBenmedium einen geeigneten Indikator zusetzen. Wollen wir fest- stellen, ob alkalische Substanzen aus der Zelle ausflieBen, so miissen wir bei diesem Versuch natiirlich ein Medium verwenden, das soweit anges/iuert ist, dab der Indikator den Farbton der sauren Scite zeigt. Nur dann k6nnen wit ja einen Umschlag nach der alkalischen Seite erkennen. Wollen wir umgekehrt ermitteln, ob irgendwelche Substanzen der Zelle beim AusflieBen einen Um- schlag nach der sauren Sci~ hervorrufen, so k6nnen wir das am besten demon- strieren, wenn der Indikator im AuBenmedium alkalischen Farbton hat. Man ist schon oft zu ganz verkehrten Schlfissen gelangt dadurch, dab man nur eine Serie yon Versuchen gemacht hat (Spek). Je starker sieh das ausflieBende Protoplasma anfarbt, umso deutlicher sind die Ausschl~ige. F/irbt es sich im Indikator gar nicht an, so erfolgt f iberhaupt kein Umsch lag , weder nacb der einen, noch nach der andern Seitc (vgl. Spek 1933). Es ergab sich, dab das aus angestochenen Amoeben ausflieBende Plasma sieh in den Clarkschen Indikatoren gar nicht oder fast gar nieht anf/irbt, wenn das Medium CaCl.,- haltig ist. Es empfiehlt sich daher, die Amoeben vor dem Anstiehversuch erst in i/20-M NaCI-L6sung zu waschen und dann in einer i/20-M NaC1-L6sung, der ein Indikator zugesetzt ist, oder in reiner w/iBriger Indikatorl6sung anzustechen.

    1) Quellwasser von den Great-Bear-Mountains und ausgekochte tIeuhalmc. Ent- scheidend fiir den erw/~hnten Effekt sind jedenfalls die Salze.

  • 384 Spek und Chambers

    Die Fs der LSsung daft nicht zu blab sein, im iibrigen ist aber die Kon- zentration des Indikators fiir das Resultat ganz belanglos. Am hiibsehesten sind die Anstichversuehe in den angess Medien, da in ihnen die F~rbung beider Plasmakomponenten erkennbar wird.

    Bringt man die gewaschenen Amoeben in 1% L6sungen yon CPR, BCP oder PR, die bis zum Erscheinen des sauren Farbtons mit HC1 ange- s~uert wurden, und reil~t sie mit scharfen Nadeln an, so tritt sofort in der orange- gelben CPR-LSsung ein karminroter , in dem gelben BCP ein v io le t te r , und in der gelben PR-L6sung ein ro ter Hof um die Zellen auf, der sich immer wetter ausbreitet. Diese H6fe werden vom ausst r6menden Hya lop lasma erzeugt. Manebe Amoeben flieSen in der sauren Farbl6sung schon yon selbst aus. Die alkalisehen HSfe k6nnen schon mit der Pr~parierlupe erkannt werden. Beim Anstechen yon Amoeben in gelbem Kresolrot tritt ke in roter Hof auf.

    Das aus f l ieSende Granu lop lasma 15st sich im Aul~enmedium fiir ge- w6hnlich nieht auf. Es klumpt zusammen und gerinnt k6rnig.. Dieses Gerinnsel nimmt in CPB allm~hlich eine orangege lbe , in BCP eine ge lbe Farbe an, in PR seheint es farblos zu bleiben. Die CPR- und die BCP-Fitrbung lassen also auf eine saure Reakt ion des Grauuloplasmas, auf eine pH desselben von ungef~hr 5,0 sehliei~en, welches gut harmonieren wfirde mit der bet den kleinen Amoeben dureh Vitalf~trbung angezeigten Reaktion des Granuloplasmas. Die F~rbung des Granuloplasmas im sauren Farbton kann man auch beobachten, wenn man die Zellen in alkalisehen FarblSsungen ausfliel~en l~f~t. - - ~ber die bet den An- stiehversuchen beobaehteten F~rbungen der Kerne werden wir auf S. 386ff. berichten.

    Wir mSehten hier hinweisen auf die auSerordentliche Ahnliel~keit, welche alas bet unsern Anstichversuchen Beobachtete mit den Farbreaktionen des aus- flieSenden Protoplasmas der Ooeyten h6herer Tiere aufweist, die Spek (1933) beschrieben hat. Trotz der vSlligen Versehiedenheit der Objekte treten uns in diesen Versuchen immer wieder die gleichen Hauptkomponenten des Protoplasmas entgegen, eine leichtdiffusible, Ieichtfliissige alkalisehe Substanz, die bet vielen frfiheren Versuchen fibersehen worden ist, und eine in Wasser gerinnbare sauere Substanz. Auch die pH-Differenzen fiir beide bewegen sich in einer ~ihnlichen Gr6f~enordnung, nur die Mengenverhi~ltnisse und der Verteilungsmodus wechselt.

    Dal3 beide Komponenten aueh in dem lebenden Protoplasma diese Reaktion haben und in irgendeiner Weise voreinander geschfitzt nebeneinander existieren, l~tf~t sich nicht an jedem 0bjekt mit der gleiehen Bestimmtheit beweisen. Be- ziiglich der Beweisfiihrung ffir andere Objekte verweisen wir auf die Arbeit yon Spek (1933). Fiir seine Objekte hat Spek aueh ausfiihrlich dargelegt, dab die Reaktion der saueren Komponente mit so etwas wie einer ,,acid of injury" nichts zu tun hat. Ein starkes Argument fiir die Priiexistenz der saueren l~eaktion des Granuloplasmas bet Amoeben ist der tiefsauere Farbton, den die ,,Gramflen" tier kleinen Amoeben annehmen, wenn man sie mit den auf S. 380 erw~hnten Indikatoren vital f~rbt. Dal~ h/~ufig nur eine der Komponenten durch die per- meierenden oder injizierten Farbstoffe gef~rbt wird, und dal~ ein Farbstoff, trotzdem er in alien Stoffen eines Substanzgemisches - - oft sogar extrem 15slich

  • ])as Problem der Reaktion des Protoplasmas 385

    ist - - doeh nur in einen hineingeht, hat Spek sehon in seiner zit. Arbeit von 1933 diskutiert. Wie in ein und derselben Zelle Kolloide mit so welt auseinander- liegendcr Reaktion nebEneinander vorkommen kSnnen, wie sie vorEinander geschiitzt sind, ist eine noch nicht gel6ste Frage und vielleicht sogar ein Grund- problem des lebenden Protoplasmas (Spek).

    Jeder Zutritt von Wasser zu den aus einer Amoebe ausfliel3en(len Sub- stanzen bringt eine fortschrEitcnde Sonderung der l)eiden H~mptkomponenten des Amoebenplasmas mit sich. ])as leichtdiffusible Hyaloplasma verteilt sich im Wasser und wird aus dem gerinnenden Granulopl~sma immEr mehr heraus- gewaschen. Dieser Faktor spielt bei Mlen Versuchen dieser Art eine groBe Rolle. AusschlaggEbend ist er auch bei Zellbreiversuchen zum Zwecke der pH- Bestimnlung, die wir zur Erg~nzung der beschriebenen Befunde noch angestEllt habEn.

    Wit stellten aus einer grSBeren Anzahl yon Amoeben (etwa 30) zun&chst unter Vermeidung von Wasserzutritt einen ZEl lbrc i her und studierten an diesem die Farbausschl~ige von zugesetzten ]ndikatoren und dann die Ver~nde- rungen des Bildes bci nachtr~iglichem W~sserzutritt unter genauester Beachtung der mikroskopischen Details bEi st~irkerer Vergr6i~erung.

    Etwa 30 Amoebcn wurden in ciner 0 ,05-~ NaC1-L6sung gewaschen und in einem Tropfen der L6sung dicht zusammengeschobEn. Dann wurde mit einer feinen Mundpipette die Fliissigkeit zwischen ihnen unter der Pr~,parierlupe fast vollst~ndig abgcsaugt und das ])eckglas raseh auf die feuchte Kammer ,~m Mikroskop gebracht. Ein ZerfliE|3en der Amo6ben beim Absaugen der Flfissig- kEit l~Bt sich bEi einiger ~bung weitgehend vermcidEn. ]~itzt man dann mit einer scharfen Mikronadel die trockengelegten Amoeben etwas an, so flieBen sie tier Reihe nach aus, und man Erh~lt eine ungetriibtE Plasmamasse, in der viEle Kerne zu sehen sind. An diesen ist keine Ver~nderung ihrer mikroskopischen Struktur zu sehen. Mit einer MikropipettE kann man dann leicht kurz vor dem ZerreiBen oder noch sauberer in den fertigen Zellbrei eine kleine MEnge einer Indikatorl6sung zusetzen. Man kann auch alas Zerreil3en der Zellen gleich in einer klcinen MengE eincr beliEbigen Indikatorl6sung vornehmen. Wir achteten abet dabei darauf, im Verhfi.ltnis nicht mehr Flfissigkcit in (tie Protoplasma- masse hineinznbringen, als m~:m etwa in lebende Zellen ohnc Schaden injizieren k6nnte.

    Es ergab sich, dab dcr so hErgeste l l te ZEl lbre i in a l len ange- wandten Ind ikatoren genau den Farbton des normalen Pro to - p lasmas annahm, den man bei In jek t ion des ]nd ikators in le- bendEn Ze l len erh/i lt . CPR wird karminrot, BCP 1)lauviolett mid PI~ ziegelrot.

    Besonders zahlrEiche Versuehe haben wir mit Bromkreso l l )u rpur ~ms- geffihrt. Folgende Details sind davon yon besonderem ]ntEresse: W//hrend des ZerreiBEns und w/ihrend des AusfliEBens der Zellen ist nicht die leiseste Andeutung einer Steigerung der Azidit/~t zu beobachten. Ja man kann das ZerreiBen der Zellen in bra.uner, a.lso schwach sa.urer BCP-L6sung vornehmen und der [ndikator ~chl/~gt trotzdem nach der a lkMischen Seite in ein tiefes ]~la.uviolett um. Auch

    ]?roloplasma. XX 25

  • 386 Spek und Chambers

    wenn man (tie Zellen mit den heftigsten ZerrbewegurNen in Stiieke zerreiBt, tr itt unter den Bedingungen dieses Versuchs keine Anderung (ter BCP-Farbe auf. 51it der Mikropipet.te dem blauvioletten BCP-Zellbrei zugesetzte kleine Tropfen yon HCI rufen fiir einen Augenbliek einen Umsehlag in Gelb herw)r, der aber his zu einer Konzentration der zugesetzten S~ure yon 0,014-N sofort wieder versehwindet, in(lem der gelbe Hof wieder violett wird. (s. hierzu S. 389).

    Ganz entspreehend waren die Resultate mit Pheno l ro t . ])as ran6 des- wegen besonders hervorgehoben werden, well ja PIr einen wesentlieh hSheren Umsehlagspunkt hat. Bei genauer Befolguag der Vorsic'htsmaBregeln, d. h. bei Vermeidung eines Zutritts yon Wasser nimmt der Plasmabrei troeken zerrissener Amoeben, wenn er mit totem Pig ,,injiziert," wird, ziegelroten Farbton an. Die Kerne f/~rben sieh etwas intensiver als in der lebenden Zelle. lhre Farbe is~ ein sehSnes Ziegelrot. Es eNibt sieh also. daf3 beim Zerreif~en der Zellen aueh niehb einmal soviel S'/iure gebildet wird, dab der PR.-Farbton des Hyaloplasmas und der Kerne in Gelt) umschl/igt.

    AIIe (liese Befunde zeigen, wie vorsichtig man mit den Vorstelhmgen yon einer, ,,acid of injury" in Einze[zellen sein muf3. Die folgenden Beobaehtungen seheinen geeignet zu sein, eine Erkl/trung ffir die Ph/inomene zu geben, die zu diesen Vorstelhmgelt gefiihrt haben. Dabei m6ehten wir allerdings betonen, dab nut das Prinzip dieser Befunde aueh auf andersartiges Zellmaterial fiber- tragen werden darf. Besonders bei Zellen mariner Ot)jekte kommen bei diesem Phfinomen noch andere Faktoren und weitere Fehlerquellen hinzu, die gesondert betraehtet werden mfissen, tlierfiber ist eine besondere Publikation yon J. Spek in Vorbereitung.

    Das (~ranuloplasma bildet in dem Zellbrei naeh einiger Zeit ein mehr oder weniger zusammenllitngendes Oerinnsel. 1)as Gerinnsel zeiehnet sieh, solange es im Zellbrei drirmen [iegt, im BCP nieht dureh eine differente F/irbung aus. Zieht man ein Stiiek davon in einen neben {len Zellbrei gebraehten Wasser- tropfen oder NaC1-LSsung, so sieht es darin farblos arts. Zieht man es dagegen behutsam in einen neuen Tropfen violetter B(?P-LSsung, so nimmt es r alhn/ihlieh ge lbe Farbe an. Aueh wenn man dem Zellbreitropfen einen grSBeren Tropfen lndika.torlSsung yon der Seite zusetzt, wird das Gerinusel yon der Peri- pherie fortsehreitend grfinliehgell> und sehlieBlieh gelb. Eine /~hnliehe Er- seheinung beobaehteten wir an den Zellkernen. Solange sic im BCP im Zell- brei drinnen liegen, sind sic alle blauviolett. Zieht man sie aber behutsam in einen frisehen Tropfen IndikatorlSsung, so werden aueh sie allmghlieh griin und sehlieBlieh orangegelb.

    Wir erkl'/iren uns diese Farbreaktionen ffir das Granutoplasma so, dal3 dutch einen 0bersehu6 yon IndikatorlSsung aus dem Zellbrei eine leieht diffusible alka- lisehe Substanz herausgewasehen wird, da.l] dann das ausgewasehene Granuloplasma aueh selbst die Fa.rbe annimmt und seiner eigenen sauren Reaktion entspreehend eben gelben Farbton zeigt. Ebenso seheint aus den Kernen in neuen Tropfen eine leiehtdiffusible alkalisehe Substanz ausgewasehen zu werden. Dabei erfolgt keine morphologisehe Ver/inderung des Kernes. ])er ausgewasehene Kern zeigt. stets in allen Teilen sauere Reaktion.

  • Das Problem der l~eaktion des Protoplasmas 387

    In CPR wird das ausgewaschene Gerinnsel orange, (lie isolierten Kerne braunorange. Beide mfisscn Mso Subst~nzen enthalten, die ein pH yon ungefiihr 5,0 haben.

    Im ziegelroten PR-Zellbrei nimmt da.s Granulopla~ma bisweilen n~ch einigen Minuten auch schon w/~hrend es noeh im Hyaloplasma eingebettet ist, einen ganz schwaehen gelben Farbton an. Neu injizierte rote PR-Tropfen wcrden aber aueh jetzt z w'is c hen den Granuloph~maflocken nic h t gelb. Ausgew~ehene Granuloplasmaflocken und Kerne nahmcn auch hier gelbe Farbe an. Die Farbe schwindet abcr bald. Nttch einer Viertelstunde nehmen (lie in NaC, l ausge- wasehenen Floeken und Kerne i ibcrhaupt, keine Farbe mehr ~m Neue auf sie gepustete scharlachrote PR-L6sung beh/i.lt ihre Farbe.

    Auch bei den auf S. 384 besehriebeaen Anstiehversue, hen haben wir beob- aehtet, dab die Kerne, solange sic noeh im ausfliegenden Phtsma drinnen lagen, in BCP und CI)I~ den alkalisehen Farbton annahmen, um dann ins AuBenmedium gelangt orangegelb zu werden. Und jetzt verstehen wir aueh eher, dall Brom- thymolblau mit seiner starken Affinit~it zu sauren Kolh)iden (Spek, 1933) in Amoeben injiziert die Kerne sofort tier zitronengelb fiirbt. Schliefilich sei hier noeh erwiilmt, dab man bei einer Vitalf/trbung und zwar bei der mit Brillant- vitalrot eine blasse Anfiirbung der intakten Kerne der lebenden Amoeba dubia und proteu.s im s~uren Farbton erhiilt. Sic f&rben sich n/tmlieh rosa.

    $

    In den beim ,,pinehing off"-Prozeg ~bgesebniirten absterbenden Plasma- kugeln erfolgt regelm/igig eine leiehte Versehiebung des ],'arbtons der injizierten Indikatoren. Hand in Hand mit einer Strukturfinderung (feine Ausf/illung) wird die F~trbung in (~PI.{ und B(JP rasch viel blasser. Dann tritt in BCP ein sehr matter grfinliehgrauer Farbton auf. Eine intensivere Fhrbung behalten die toten Kugeln in PR. lhr Farbtou ist immer deutlieh gelber als derdes lebenden Protot)lasmas. Wir haben leider noeh nieht entsehieden, ob eventuell alkalisehe Substanzen aus der sterbenden Plasmakugel herausdiffundieren. - - Die ab- gesehniirten Plasmakugeln ertmlen sieh niemals.

    2. Die Bestiindigkeit tier lndikatorreaktionen des Amoebenplasmas naeh lnjektion yon S~iuren und Basen

    Chambers (1928), gezn iko f f und Po l lack 0928) und Po l lack (1928) haben in die mit Indikatoren injizierten Amoeben nachtr~glicb noch S~iuren oder Puffergemische yon eincm pH, welches yon dem des Protoplasmas abwich, injiziert und dabei festgestellt, dab sich die Indikatorfarbe nut ffir cinen Moment tindert un(l dann sogleich wieder zu der (ler normalen P]asmareaktion zuriick: kehrt. Wir haben fiber dieses Problem der Sicherung des pH der lebenden Zelle eine grebe Serie yon Versuchen mit S~iuren und Basen angestcllt und dabei wieder die gleiche Methode der gleichzeitigen Injektion mit dem Indikator angewandt. I-[ierbei mul3 man wohl mit ciner leichten Vcrschiebung des pH der Mischung durch Weehselwirkung der S~ure oder der Base mit dem Farbsatz

    25*

  • 388 Spek und Chambers

    rechnen. Es ist nicht eilffach so, als ob die S/iure oder Base bekannter Normal- konzentration durch Zusatz tier IndikatorlSsung einfach verdfinnt wiirde, wie wenn man destilliertes Wasser zusetzen wtirde. Aber diese kleine Ungenauigkeit ist fiir unsere Bctrachtungcn ganz belanglos. Auch unsere Zahlen, die wir / f i r Grenzkonzentrationen ftir eine bestimmte Wirkung angeben, sind nur als an- n~ihcrnde Werte aufzufassen, (ta bei kleinen und mittleren Injektionen (lie injizierte L6sung im Protoplasma noch verdiinnt wird, die Injektion grol3er Mengen aber eo ipso fiir physiologische Versuche nieht brauchbar ist. Aber auch eine ungef/ihre Orientierung fiber die quantitativen Verhi~ltnisse schien uns nicht ohne ]nteresse zu sein.

    Um bei den Versuchen und S/i, u ren auch gleieh festzustellen, ob sich bei Vertretern verschiedener Gruppen yon S/iuren eine prinzipiell verschiedene Wirkungsweise geltend macht, haben wir zu unseren Versuchen anorganische und organische, oberfl/ichenaktive und inaktive S/iuren ausgesucht. Injizicrt wurden: Sa, lzs/ iure 0,00175-N, 0,0035-N, 0,007-N, 0,014-N, 0,02-N und schlie/~lich 1,0-N; But ters / iu re : 0,0025-N, 0,005-N, 0,01-N, 0,014-N, 0,025-N, 0,03-N, 0,04-N und 0,1-N und Mi lchs/ iure: 0,005-N, 0,01-N, 0,02-N, 0,03-N und 0,05-N. Koh lens /~ure wurde aus einem Kippschen Apparat in die feuchte K~mmer auf dem Mikroskop eingeleitet. Als Indikatoren wurden CPR, BCP und PR verwendet.

    Nat r iumhydroxyd wurde mit den Indikatoren PR und TB in Kon- zentrationen von 0,005-N, 0, l -N, 0,25-N und mit kolloidchemischen Frage- stellungen in noch h6herer Konzentration injiziert. Ammoniak wurde als Gas in die feuchte Kammer eingeleitet (Indikator PIe und CR).

    An Einzelheiten m6chten wit aus der langen Reihe unserer Versuche hier folgendes berichten :

    Zuns li~Bt sieh in einem htibschen Demonstrationsversueh zeigen, dab dcr normale Farbton tier in j i z ie r ten Ind ikatoren von dem pH des Au l3enmediums unter best immten Bed ingungen vSl l ig unabh/ ing ig ist. Wir setzten dem Kulturmedium BCP zu und s/iuerten dann durch tropfenwcisen Zusatz von 0,01-N HC1 das Wasscr so welt an, dal3 das BC1 ) einen tier zitronengelben Farbton annahm. Die Amoeben bleiben darin am Leben und unverandert. Injizierten wir nun in Amocben, die sich im h/in- genden Tropfen in diesem gelben Medium befanden, neutrale BCP-LSsung, so nahm der Zellinhalt sofort den norma.len blauvioletten Farbton an.

    Ebenso eindrucksvol[ ist bei unscrer Versuchsanordnung der Hauptversuch mit all den S~iuren ~) : Bis zu e iner gewissen Grenzkonzent ra t ion schlfi, gt die t ie fge lbe Farbe des Gemisches der Ind ikatoren mi t der S~iure im Augenb l i ck tier In jek t ion der M ischung in der Amoebe zu dem Farbton des normalen Pro top lasmas urn, wird also in CPgkarminrot , in BCP blauviolett und in PR orange. Eine Verschiebung des Farbtons nach der sauren Seite li~Bt sich in C1)lg und BCP tiberhaupt erst mit einer Siiure- konzentration erreichen, die auch schon eine irreversible Koagulation des Proto-

    1) Die Vcrhiiltnissc in Kohlensiiure miisscn besonders besprochen werden.

  • Das Problcm der Reaktion des Protoplasmas 389

    plasmas bewirkt. Eine noch physiologische Ab~inderung des pH--s ist durch die ]n jekt ion dieser S~turen in diesen Ind ikatoren i iberhaupt nicht mSglich. In PR ist die Grenzkonzentrat ion, bis zu der es auch noch in Ir umschl~gt, etwas niedriger. ]]ber ihr bleibt es gelb, ohne dab die S~ture schon koa.gulierend wirkt.

    Die Grenzkonzentrat ion, bei der Koagulat ion und Gelbf~rbung in BCP und CPI~ erfolgt, l iegt bei den drei Sauren nicht sehr weit auseinander, abet es ergab sich bei unserer Versuchsanordnung, die wie gesagt, nut E rmi t thmg an- ni~hernder Werte crlaubte, immerhin eine deutl iche Abstufung. Diese Grenz- konzentrat ion liegt fiir Salzs~ure bei ungef/ihr 0,014-N, fiir Butters~ure bei fiber 0 ,02-N und ffir Milchs~ure bei ungef~hr 0,03-N. Das pH dieser S/~urcl6sungen ist nicht f ibereinstimmend, das der Salzs~ure ist wesentlich h6her als das der iibrigen S~uren. Die Grenzkonzentrat ion bis zu der sogar PR noch zum normalcn Ziegelrot umschl~tgt, ist fiir HCl ungei~ihr 0,0035-N, abet diese L6sung hat immer noch ein pH yon ca.. 2,6. Bis zu dieser enormen Entfernung vom normalen pH-Wert wird a/so die norma.le Reakt ion der Plasmatei lchen nach Salzsiiure- in jekt ion aufrechterhalten !

    Ents teht bei den S/~ureinjektionen mit ()PIe und BCP bei der Grenzkon- zentrat ion nur lokal um die P ipette ein Koagulat , so f~rbt sich nur dieses orange bezw. gelb. Das iibrige Protoplasma n immt den normalen roten oder violetten Farbton an.

    Oberhalb der erw~thnten Grenzkonzentrat ion yon HC1 fiir den Farben- umschlag yon PR. (0,0035-N) scheint sich der ganze Char~kter der Phenolrot- f i irbung bei Gegenwart der S~hlre zu iindern. Der gelbliche Farbton ist ~tuBerst blaB. Das Hyalop lasma erscheint, wenn es in hyal inen Pseudopodien gesondert hervortr i t t , so gut wie farblos. Diese Konzentrat ion yon HC1 wirkt noch nicht koagulierend.

    Wir lassen einige Protokol le folgen: Versuch mit Salzsi iure 0,007-N gemischt mit gleichen Teilen einer 1 ~ o bl-aunen

    BCl)-L(isung. Es wurden gleiche Teile von HC1 0,014-N und B('P l ~ o gcmischt. Farbc der Misehung tiefgelb, pH yon reiner HC10,007 ca. 2,4. [njizierte Misehung sehl~tgt im ganzen Zellk6rpcr sofort in tiefes blauviolett urn. Es tritt sehr rasch ,,pinching off" ein, abcr der am Leben bleibendc Rest zeigt noch stets blauviolettc F~irbung. Klares Hyaloplasma er- schcint stcts blaBviolctt. - - Die abgeschniirten Kugeln werden graugrfin. Ihre Kcrne cbenso.

    Versuch mit Salzs~ture 0,014-N und BCP. [njiziert wird cin Gemisch yon gleichen Teilen HC1 0,028-N -: BC1 ) 1 (~o braun. Misclmng tier gelb. pH yon 0,014-N rein ist un- gef~thr 2,0-2,2. Farbe schl~igt in der Zelle sofort zu blauviolett urn. Bei ]njektion yon grOBerer Fliissigkcitsmenge entsteht lokal um dic Pipette ein tiefgelbcs Koagulat, eine Zeitlang noch umgcben von violettem strSmendcm Protoplasma.

    Versueh mit Salzsi~ure 0,0035-N und PR. Injiziert wird tin Geraisch von gleichen Teilcn yon HC1 0,007-N ~ PR annMmrnd neutral 1%. Misehung tiefgelb, pH yon HC1 0,0035-N rein ungef~thr -- 2,6. Farbc schl~tgt in den Amocben sofort zu cinem blassen Ziegel- rot urn. [n vielen FMlen naeh mittlerer :Injektion langsame Abschniirung. Abgeschniirte abstcrhende Kugeln wcrden gelb. Im lebenden Zellrest erfolgt stets eigcntiimlicher Wcchsel des Charakters der F~irbung. Diese wird im ganzen allmiihlich sehr blaB. Hyalo- plasma erscheint so gut wie farblos. Abcr zentrale Zellmasse erscheint blaBgelblich. - - Die Parbe wird in den sauren Gemischcn yon ausflicB(,ndem Protoplasma so gut wie gar nicht adsorbiert.

  • 390 Spek und Chambers

    Versuch mit Buttersiiure 0,02-N

    (Buttersiture 0.04-N ~' CPR 1% orangerot)

    Die Farbe schlggt in der ganzen Zelle zu einem tiefen rosa urn. Gar keine Ko- agulation oder hOehstens eine leiehte An- deutung davon in der Pipettenmiindung. Stets Absehntinmg. l)er rcstliehe rosa Tell der Zelle stirbt hi~ufig ebenfalls. Manche AmOben flicl~en nach der Injektion aus.

    u mit Salzsiiure 0,02-N

    (Salzsaure 0,04-N + CPI~ 1% orangerot)

    AuBerordentlich st~,rke Koagulation des Protoplasmas, die sogleick orangegelbe F/ir- bung annimmt, wenn gleiche (mittlere) Menge injiziert wird, wie im Butters/iure- versueh. Bei kleinen Injektionen kann Koagulation lokal bleiben und der Rest der Zelle rosa Farbe annehmen. Ill dicsem Fall kann der am stgrk~ten alterierie Tell ab- gesc]miirt werden und der andere bleibt am Leben.

    G~mz analog fielen bei diesen Sgurekonzentrationen Versuche mit BCP aus. Vergleicht man die Wirkung der S~mren auch in andercr Beziehung, ihre

    Toxizitat und ihreu Einflul~ a.uf die Bewegung amd die Indikatorenfarbe des Plasmas, so f/tilt zun/i.chst die ger inge Spez i f i t / t t und Tox iz i tg t der But ters / iu rewi rkung auf, (lie in starkem Kontrast zur Wirkung dieser S/iure anf anderes Zellmaterial steht, aber andrerseits iibereinstimmt mit der geringen Empfindlichkeit, (tie Amoel)en auch fiir anderc stark ol)erfl'achenaktive Substanzen wie Saponin zeigen. Auch mit Butters/iure und Milchsiiure liiSt sich eine Verschiebung der normalen CPR und BCP-Farbe des Protoplasmas, wie erw/~hnt, erst in Konzentrationen, welche schon eine K oagul~tion des Protopla,~mas hervorrufen, erreichen, ist also nicht mehr physiologisch und auch hier mehr oder weniger auf das k6rnige Koagulat begrenzt. Trotzdem aber in schwgeheren Konzentrationen aller S/iuren die Farbe tier genannten Indikatoren in tier gleichen Weise zu der normalen Farbe (los Hyaloplasmas umschl'agt, weisen die mit den drei Sguren injizierten Amoeben ein eharakteristisch verschiedenes Aussehen auf. ]hr Bewegungstypus ist n/~mlich verschieden. Nach der Salzs/h,reinjektion treten h/infig kr~iftige Font/tnenstrSmungen auf, oder es resultiert blol] eine Steige- rung der Bewegung ohne charakteristische J~nderung ihres Typus, nach B u t te r - s ~ u r e und Mi 1 c h s'g u r einj cktionen erh'al$ man dagegen nt~ch einiger Zcit langsam fliel~ende phantastisch gelappte Formen, deren Habitus in den beiden S~turen eine gewisse Ahnlichkeit hat, aber doeh wiederum nicht ganz Obereinstimmt.

    In allen Sguren wurde eine Abschniirung der am meisten betroffenen Stelle beobachtet, doeh erfolgt sie nicht so ausnahmslos wie nach den CaCl2-Injektionen. Koagq~lierend wirkende Sgurekonzentrationen rufen eine Abschn~irung nut hcrvor, wenn ein Tell tier Amoebe noch am Leben bleibt. St/trkere Koagulationen erfolgen so rasch, (lab schon deswegen gar kein pinching-off mehr erfolgen kann.

    Zusammenfassend k6nnen wir feststellen, dab die Wirkungsweise yon allen drei Sguren tiber Erwarten gleichf6rmig ist, und dal~ Unterschiede mehr nut quantitativer Art sind. Der Hauptbefund ist die Best/mdigkeit der Indikator- farbe der yon den Indikatoren gef/irbten Plasmakolloide sclbst nach Injektion yon erheblichen Sgurekonzentrationen. Um so iiberraschender ist es nun, dab aus d ieser Regel das Verha l ten der mit Ind ikatoren in j i z ie r ten Amoeben im Koh lens i~nrest rom vo l l s tgnd ig herausf/~llt . Wirwerdcn

  • Das Problem der I~aktion des Protoplasmas 391

    fiber die,se Versuche erst an sps Stelle beriehten. Erst schiiellen wir hier die Beschreibung der In jekt ionen von Basen an, die zu den S~ureversuehen ein vollst'~ndiges Gegenstiick m~eh der anderen Seite darstellen.

    Der Hauptbefund [st, dal~ die Farbe yon Phenolrot, wenn es zusammcn mit Natronlauge inj iz iert wird, bis zu einer sehr hohen Konzentrat ionsgrcnze der Base im Amoebenplasma zum normalen Ziegeh'ot umschl~gt, welches einem pH yon ungef~hr 7,3 entsprieht. Dieser Umschlag erfolgt selbst nach In jekt ion yon NaOH-L6sungen, wclche mit Thymolb lau ein ausgesprocbenes Blau geben, also ein pH yon fiber 9,0 haben miissen. Das Pheuolrot wird (lurch sic natfir l ich tief rosa gef~rbt. Mitt lere Mengen eincs Gcmisehes yon Phenolrot 1 ~ mit 0,1-N NaOH schlagen in der Amoebe noch [~mgsam zum normalen RStl ich- ()range urn. Auch hier [st es wiederum so, da[l man you dcr Konzentrat ion einen gewissen Abstr ich machen mull, dadurch, (tab der inj izierte Tropfen in der Zellc verdfinnt wird, und andrerseits eine ln jekt ion von gro[3cn Mengen yon NaOH unphysiologische Verhi~ltnissc sehafft. Abcr man kann selbst be[ In jekt ionen yon NaOH wenig unter 0 ;1-N beobachten, dab d~s Plasma auch bei d i rekter Vcreinigung mit der inj izierten LSsung sofort den Umschlag der Farbe in Ziegelrot bewirkt. Es [st crstaunlich, dab man nach kleinen In jekt ionen yon 0 ,1-N noch vollst~tndige Erholung feststellen kann. Nach der in jekt ion erfolgt noch kr~iftige Str6mung im Protoplasma, die ausgcstrcckten Pseudopodicn werden dann zuriick- gezogen und die Amoebc rundct sich [)is ~uf wcnigc kleinc Fortsi~tze ab. Abcr n~ch einer Minute kOnncn schon wieder neue schlanke Pseudopodien erscheinen. Wi t betonen, da13 wir uusere NaOH-LSsungen yon einer neuhergestel lten, t i t r ierten und gegen Kohlens~iure-Aufnahme sorgfKltig gesicherten Stamml6sung her- stellten, l)aB die toxische Wirkung der Alkali lSsung nicht besonders hoch [st, [st vielleicht zum Teil dadureh zu erkli iren, da$ das Oaleium in der Zelle und, was (tie Membran betrifft, viel lcicht auch das Calcium des Aul3enmediums der Alkal iwirkung entgegenwirkt. Setzt man mit NaCl gewaschene Amoeben ganz in verdi innte LSsungen yon NaOH, so erh'~lt man in einem Konzentrat ions- bereich von 0,001-N his zu 0,5-N eine Aufl(isung der Zeilen, die aber schon durch geringe CaC12-Zus~itze vSllig vcrmieden werden kann.

    Da (lie Versuchc einiges boten, was kol loidchemisch yon Interesse zu sein schien, haben wir sic etwas genauer ausgebaut. Wir ffigen hier einen kurzen Berieht (larfiber ein:

    In r(,inen LOsungen wm Nat r iumhydroxyd in Konzentrationen yon 0,001 bis 0,05- N nehmen die Amoeben das Ausschcn ciner mit vielen kurzen Papillen besetzten KugeI an. Die Pap[lien sind racist hyalin, doch sicht man gclcgent.lieh auch das Granuloplasma in sic vorfliellcn. Nach kurzcr Zeit sieht man dann pl6tzlich einc Am(~vbe ausflieflen, und kurz darauf crleiden die iibrigen das gleiche Schicksal. Die Membran 16st sich erst lokal, dann ringsum vollst4ndig auf. I)as Plmsma brcitct sich in dcr Fliissigkeit aus. Nur Kris~alle und N~hrungsvakuolen bleibcn noch IEngere Zeit crhMten, abet aueh die Kristalle ze!gen cine I)artielle Aufl6sung. Das ZcrflieBen dcr Amoeben crfolgt in 0,005-N NaOH nach etwa einer Minute, in schw~cheren und st~rkeren Ix)sungcn me[st ctwas langsamer. (In 0,001-N NaOH zerf]o$ die crate Amoebe in 10 M inu~n, in 0,002- N NaO H in 2 Minuten.) Zus~tze yon 0, ! 25- M NaCl-L6sung ]ruben die Aufl6sung etmr gcfOrdert, Zus~tze yon 0,05-M CaOle haben sic v611ig aufgehobcn. Die Versuche warcn mit eincm Gemisch yon gleichen Tcilen yon 0,1-N NaOK

  • 399 Spek und Chambers

    und 0,05-M CaC]~ ~ngesetzt. Die Amocbcn bleiben darin am Leben. H0here Konzentrationen yon Nat.riumhydroxyd von etwa 1,0- N an verwandeln das Granuloplasma zu einer zusammen- hi~ngenden schncidbaren gelartigen Masse. Die Aufl6sung der Membran erfolgt schwerer oder gar nicht.

    Wir sehen aus den Indikator- + Alkali-Versuchen, dab eine Ab~nderung der normalen Phenolrotfarbe des lebenden Protoplasmas durch die Injektion der La.uge nicht erreicht werden kann. Nach Injektion yon Konzentrationen jenseits der physiologisehen Grenzc, die die Zellc raseh t6ten, bleiben rosa L6- sungen ros~.

    Die Resistenz der lndikatorf~rbung des lebenden Protoplasmas gegen injizierte S~turen und Alkalien erseheint noch erstaunlicher, wenn man die Re- sultate der beiden Versuchsserien zusammenh~tlt und sich klar macht, dab es eine Konstanz der Farbe in einem pH-Bereich von ungefs 2,5 bis gegen 9,0 w~tre!! Und die Konstanz der F~trbung ist in diesem pH-Bereich noeh dazu nicht nur eine relative der Art, dab naeh der S~ure- odcr Base-Injektion eine mehr oder weniger weitgehende Regulation der l~eaktion gegen den norm~len Wert yon 7,3 erreieht wird. Nein, der diesem Wert entsprechende Farbton kann unter den genannten Umst~nden iiberhaupt nicht umgeworfen werden!

    Rezn iko f f und Po l lack haben, als sie die erstcn Andeutungea dieser VerhMtnisse fanden, ohne ZSgern geschlossen, (t~B dem Protoplasma eine aus- gezeiehnete Puffer-Einriehtung zukommen mfisse, und Chambers hat sich dieser Deutung angeschlossen. Spek vertr itt da.gegen die Ansieht, dab man, sola.nge ein direkter Beweis fiir die Existenz irgendeines Puffersystems in der Zelle nieht erbracht werden kann, wenigstens die Frage aufwerfen sollte, ob das Erhaltcnbleiben der normalen Indikatorfarbe auch bei Siiure- und Alkali- injektion nicht auch dureh andere Fa.ktoren verursacht sein k6nnte. Eine Er- kl'~rung der absoluten Besti~ndigkeit der Indikatorfarbe durch pufferartige Eigensehaften amphoterer EiweiBk6rper kommt nicht in Frage, da dutch diese immer nur eine sehr relative Verschiebung des I)H nach Zusatz einer S'~ure oder Base gegen einen Mittelwert (n'~mlich den isoelektrischen Punkt des betr. Eiwei6kSrpers) erreicht wird. Aber was wir beobachteten, ist eigentlich auch welt mehr als das, was man yon einem guten Puffergemiseh erwarten kann, und der Erkl~rung der Erscheinungen durch ein Puffersystem entstehen neue grol]e Schwierigkeiten, wenn man sic auch auf die gleieh zu besprechenden Versuehsergebnisse mit Ammoniak und Kohlens~ure zu iibertragen sucht. Aus der Beweisfiihrung yon Spek (1933), dab in vielen Zellen offensichtlich Plasmateilchen versehiedener Reaktion nebeneinander vorkommen, die in irgendeiner Weise, vielleicht durch ein Schutzkolloidsystem gegeneinander geschiitzt sind, ergibt sich aber aueh fiir das bier er6rterte Phi~nomen noch eine neue Erkliirung. Denn sind, sagen wit, alkalische 1)lasmateilchen gegen im gleiehen Plasma vorkommende saure Partikel gesel)iitzt, dann ist es ohne weiteres denkbar, dal~ sie aueh gegen die hereingebrachtea Sguren oder Alkalien gesehiitzt sind, dab diese an die betr. Kolloidteilchen vielleicht gar nicht berankommen, so ~hnlich wie im GroBen ctwa dureh die Zellmembran zwei Medien sehr versehiedener l~eaktion voneinander getrennt werden k6nnen. Die injizierten Alkalien und

  • Das Problem der Reaktion des Protoplasmas 393

    S/~uren gelangen zun/ichst nur in das ])ispersionsmittel des Protoplasmas hinein. Von der Natur des Schutzes der Tcilchen einerseits und yon den Eigenschaften der S~ure bezw. des Alkalis andrerseits wird es abhitngen, ob sie in die Kolloid- teilchen selbst eindringen k6nnen. Diese Betrachtungen werfen auch ein be- sonderes Licht auf unsere Versuchsresultate mit Ammoniak und Kohlens/iure, welehe wir nun beschreiben wollen.

    Injiziert man eine Anzahl Amoeba dubia mit 0,5 % Phcnolrotl6sung, so nehmen sie alle den gleiehen blall-ziegeh'oten Farbton an. Einige schniiren eine Plasmakugel ab, aber der Rest der Zelle ist immer noch deutlich genug gefs und verh/ilt sich ganz wie eine normale Amoebe. Wit sammelten nun cine Anzahl Phenolrotamoeben und fiihrten mit ihnen Versuchc mit Amm o- n iak aus. Die Amoeben wurden in den h/~ngen(ten Trot)fen auf dem Deckglas gebraeht, und dieses auf (lie feuchte Kammer aufgelegt. Dureh die 0ffnung der feuchten Kammer wurde eine lang ausgezogene Pipette yon etwa 1 mm Durchmesser neben der Mikropipette eingefiihrt. Sic war mit 10 ~ igcr Ammoniak - 16sung geffillt. Das fliiehtige Ammoniak erfiillte bald den ganzen Raum der feuchten Kammer und lieB in 5--8 Sekunden den z iege l ro ten l , 'a rbton unserer Pheno l ro tamoeben in ein t ie fes Rosa umsch lagen. Sowieder (:mschlag erfolgt war, wurde (lie Ammoniakt)ipette stets sofort entfernt un(l die feuchte Kammer ausgeliiftet. Ein zu tanges Einleiten yon Ammoniak kann die Amoeben t6ten. Eine kurze Behaudlung mit Ammoniak bis zum erfolgten Um- schlag kann bei einiger (~bung ohne weiteres so durchgefiihrt werden, (]alt alle Tiere am Leben t)lciben. Wenn (lie Amoeben sehon rosa Farbe angenommen haben, k6nnen sic noch, unter Umst/inden soga.r sehr lebh,~fte, aufgeregte Be- wegungen ausffihren. Eine ~nderung der Reaktion des Protoplasmas braueht a|so nicht co ipso Bewegungsstillst~md herbeizufiihren. Nachher wcrden dann die beha.ndetten Amoeban vortibergehend etwas tr/ige. - - 1lie rosa FArbung geht allm/ihlieh wieder zuriiek, und im Laufe von e twa 20Minuten er langen die T ie re ihre normale z iege l ro te F~rbungwieder . Dabei nehmen sie auch die Bewegung in v611ig normaler Weise wieder auf. - - Die Farbe des Phenol- rots sehl~tgt in den toten abgeschnfirten Plasmakugehl bei der Ammoniak- einteihmg auch stets in Rosa urn.

    Fiir die Analyse der Fs scheint von Interesse zu sein, dab in der Farbung nicht die allergeringstc Heterogenit/it zu sehen ist, da{] die tiefe rosa Farbe abs~)lut gleichf6rmig verteilt ist, als ob (]as Ammoniak an jedes Farb- tcilchen her~mkommcn wiirde, ganz gleich, wo sich das Farbteilchen befindet. Niemals sind auch nur (tie geringstcn quantitativen oder qualit~tiven Untcr- schiede in der FSrbung zu sehen.

    Aus dcm Gesagtengeht horror, da[~ es ohne we i te res m6g l i ch ist , die normalc Ind ikator f / t rbung des P ro top lasmas durch ganz kurze Behand lung mi t Ammoniak in revcrs ib le r Weise umsch lagen zu lassen , ohne da[] (tie Re~ktions'hnderung eo ipso eincn ]3ewegungsstillstand herbeifiihrt.

    Wir versuchten hierauf die Alkalinit/it in der lebenden Zelle (lurch Am- moniakd~mpie noch welter zu erhShen bis zum Umschlag yon Krcsolrot in Violett.

  • 394 Spek und Chambers

    Dies |st tlns jedoeh in revers|bier Weise nieht gelungen. Wir injizier~n eine Anz~hl yon Amocben mit ] ~ gelber CR-LSsung. Sic |st nieht ganz so unschiidlich wie PR. Von vielen Tiercn wird nach der Injektion cine Kugcl abgeschniirt. Die lebendcn Amoeben und (lie abgesehniir~n Plasmakugeln we|sen cine gelbe Farbe auf. Die Einf(ihrung einer Ammoniakpipette bcwirkt, dai] zuerst die Farbe (ler to ten P lasmakuge ln von Gelb zu Purpur ro t umschl '~gt . Zwischen diesen purpurroten Kugeln kriechen aber die lebenden Amocben mit lebhaften Bewegungen herum nnd haben noeh ausnahmslos ihre gc lbe Fhrbung. Naeh friihestens 10 Sekunden schliigt (lann die Fa.rbe auch in ihnen urn, aber wcnn das erfolgt, sind (lie Amoeben stets schon bewegungs- los und erholen sich nicht mehr. Das Ammoniak kommt wahrscheinlich an das Kresolrot in den toten Zellen aus irgendeincm Grunde leichter heran, und trotz- dem die toten Plasmakugcln vor (|or Behandlung eine saurere Reaktion habcn als dic lebeuden Amoeben, wird in ihnen dutch Ammoniakbehandhmg in wenigen Sekunden ohm Alkalinit~tt erreieht, die Kresoh'ot in Purpurrot umschlagen l~il3t.

    $

    Ebenso wie mit Ammoniak nach der alkalischen, 151It s~ch mit Koh len- s~ture spielcnd leicht einc Versehiebung dcr /ndikatorfarbcn des lebenden Amoebenplasmas naeh der sauren Seite erreichen, lnjiziert man wiederum eine Anzahl yon Amoeben mit Phcnelrot, sammelt sie im h~ingcnden Tropfen nnd leitet dann aus einem Kippschen Apparat Kohlcnsiiure in dic feuehte Kanlmer ein, so seb l~gt me|s t schon nach e iner Sekunde (!) die z iege l ro te Farbc in ein Z i t ronenge lb urn. DieBewegtmghSrtauf . Abcr unterbricht man die C()2-Zufnhr sofort, so kehrt Hie bald wiedcr, und ebcnso crfolgt einc Verschiebung des Farbtons zuriick zum normalen Zicgelrot, welches nach 30 Se- kunden vSllig wicderhergestellt |st. Dann kann ma.n den Versuch in der gleichen Weise wicderholen.

    Als wit diese Phenolrotumschliige sahen, waren wir zun~ichst /iberzeugt, dal3 die Wirkungsweise der Kohlenshure ein vSlliges Gcgenstiick zu der des Ammoniaks darstellt. Als wir dann abet den Kohlens~ureversuch mit Amoeben wiederhoIten, welche mit BCP und CPR injiziert watch, kamen uns doeh manche Bedenken. F/Jr diese be|den lndikatoren erg~b sich n~im/icb, dal3 ein s~mrer Fa.rbton und zw~r ein blasses Zitronengelb in BCP und ein ()range in CPR m c h r oder wen iger nur im Granu lop lasma ~uf t r i t t , w~ihrend das Hya lo - p lasma e igent l i ch nur b lasser und nach liingerer Einteihmg yon CO., fast farblos wird. Es wird in CPR nicht ()range, sondern nur im|3erst bla~ rosa, in BCP nimmt cs einen blassen graucn Farbton ~n, w~hrend der saure gelbe Farbton wieder im Granuloplasma erscheint. Es |st |miner ein gewisser Farbcn- unterschied zwischen Hya.loplasma- und Granulopl~smaf'hrbung zu erkennen. Auch be| den Versuchcn mit diesen Indikatoren erscheint dcr normale alk~lische Farbton, a|so ein Blauviolett in BCP und ein Rosa in CPR nach etwa 20 Sekunden wieder, und der Versuch l~tl3t sich noch oft wiederholen. Bemerkcnswert ist noch, dai3 auch der Zcllkern in diesen Indikatoren nach Einleitung der Kohlen- siiure sanren Farbton a.nnimmt.

  • 1)a,s Problem der Reaktion dcs Protoplasmas 395

    Wie wit sp~ter noch sehen werden, hat die Kohlensgurewirkung auf CPR.- und BCP-Amoeben grebe J{hnlichkeit mit der eigentiimlichen -Anderung tier Fiirbung, welche gewisse Salze aueh in neutraler oder gar ~dkalischer LSsung hervorrufen, wenn sic mit den gleichen Indikatorea zusammen injiziert werden. Spek mSchte daher fiir beide Erseheinungen die gleiehe Erkl~irung geben, auf welche wir sp~iter nach ErSrterung der Calciumversuche eingehen werden. Wie aber (lie Erkls der CO2-Wirkung sei, sicher steht, dall d~e Kohlenss in tier Zelle n ieht wirkungslos gemacht ~ird, sondern in kiirzester Zeit eine vSllige Verttnderung des F~irbungsbildes und Narkose hervorruft, l)~bei kommt (tas pH einer Kohlens~iurelSsung, selbst wenn Einleitung his zur S~tttigung erfolgt, an das pH der noch nicht koagulierend wirken(ten Salzsiiurekonzentra.tion lange nieht heral~ (pH yon Kohlensiiure in Wasser, gcsttttigt 4,0---3,5). Auf der t~ndern Seite bewirkt Ammoni~tk (lie Versehiebung des pH offenhar noeh bevor es auch nur eine Konzentra.tion erreicht, welche Kresoh'ot umsehlagen laltt, demt wenn es dies tut. gehen ja die Amoeben ein. Auff/illig ist auch, dall die Amoeben- zelle gerade gegen (tie Wirkung yon Kohlens'hure und Ammoni~k, die im normalen Betrieb der Zelle tats~chlieh eine Rolle spielen k6unten, so wenig gesichert ist.

    Auch Ammoniak und Kohlens's werden woh] erst eine gewisse Konzen- traction in der Zelle erreichen mtis~n, ehe die Indik~,torfarbe umschl~igt. Unter ihr bleibt die normale Indikatorfarbe erhalten, auch wenn die Stoffe scbon in die Zelle eingedrungen sind. Das hat Chambers schon 1927 und 1928 wahr- scheinlich gemacht. Wir habea diese Versuche jetzt nieht wiederholt.

    3. Der Einflul~ der Saize au[ die Indikatorfarbe des Amoebenplasmas

    a) Versuehe mi t Ca lc iun~chlor id

    Fr~ihere Untersuehungen yon Chain be r s und seinen Mitarbeitern hatten gezeigt, dal3 die Farbe tier in die Amoeben injizierten Indikatoren dureh neutrale Salzl6sungen, die ebenfa.lls durch [njektion in die Zelle gebra,cht wurden, ge- ~indert werden ka.nn, dal3 auff~illige sa.ure Farbt(ine auftreten kSunen, we vorher eine alkalischere Iudikatorfa.rbe zu sehen war. Die diesheziigliehen t~efunde an Amoeben sind yon Rezn iko f f ua(l Po l lack (1928) und yon Pol i t ick (1928) publiziert worden. Um eine Analyse der schwerverst~tndlichen Erscheimmg zu versuchen und ihren Geltungsbereich aueh bei ~nderen Substanzen zu priifen, haben wit eine groi~e geihe neuer Versuche zu dieser Frage durch- gefiihrt; besoaders zahlreiche mit Ca le iumch lor id . welches zus~unmen mit den Indikatoren Brompheno lb lau , Bromkreso lgr i in , Methy l ro t , Ch lor - pheno l ro t , B romkreso lpurpur , Bromthymolb lau , Pheno l ro t und Kreso l ro t in Konzentrationen yon 0,5, 0,25, 0,166, 0,15, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156, 0,00625 mad 0,003125 injiziert wurde. Die Versuche mit allen iibrigen Salzen gruppiercn sich um diese C,~Cl2-Versuche, so da[l wit zun~chst sic ge- nauer besprechen miJssen.

    Ein typisches Bild erhiilt man, wenn m~m etwa ein Gemisch yon gleichen Teilen 0,0625-M CaC1 e und 1% Bromkresolpurpur injiziert. Meist verwendeten

  • 396 Spek und Chambers

    wir Mischungen, deren Re~ktion so korrigiert war, d~B sie braunviolette Farbe batten, das pH also eirea 6,0 betrug. Reine BCP-L6sungen yon dieser Farbe sehlagen im Amoebenplasm,~ ausnahms]os in ein tiefes gleiehm/~Biges Blau- violett urn. ]ajiziert man jedoeh d~ oben erw~hnte Gemisch yon BCP -4- CaCle 0,0625-M so wird sofort d~s ganze undeutlich konturierte Sehwammwerk der zentralea Masse des Granu lop lasmas z i t ronenge lb , w/ihrend das k la re Hya lop lasma, wo immer us gesondert hervortritt, blab b lauv io le t t gcf/~rbt erschefilt. Der Untersehicd in der F/irbung ist aufs Sch//rfste ausgepr/igt und miihelos zu erkennen.

    ]Die lnjektion der C~t-haltigen Mischungen hat immer Absehniirung der am meisten alterierten Region zur Folge. Die Farbver/inderung am Granulo- plasma ist abet stets schon vor Beginn der Abschniirung zu sehen.

    ]Die gelbe F/irbung des Gramtloplasmas verscbwindet in dieser CaCI 2- Konzentration sehr raseh, undes bleibt dann nur noch eine blasse violette F~rbung iibrig.

    ]Das sich gelbf/irbende Granuloplasma zieht sich nach der Injektion etwas diehter zusammen. Die Kristalle werden zum Untersehied von andern Salz- wirkungen in dieser viskosen Masse stets festgehalten. Eine grSbere kolloid~le Znstandss ist nieht zu beobachten. C h am bers und Rez n iko f f haben diese Veriinderungen sehon in frfiheren Publikationen (s. bes. 1926) genauer besehrieben and sit als ,,solidifie~tion" bezeichnet. Geht m~m mi tder Konzen- tration des CaCI 2 hSher hinauf, so wird die KontraktioD des Granuloplasmas noeh ausgepr/~gter, das viskose Schwammwerk rtickt noch dichter zusammen und erleidet dann yon etwa 0,125-M an auch eine irreversible Struktur'~nderung, welche mit dem identisch ist, was wit bei der Wirkung hSherer Salzs/i.m'e- konzentra.tionen als k(irnige irreversible Koagulation bezeichnet haben.

    Je hSher die CaCl~-Konzentration, um so intensiver die Gelbf~rbung des Granuloplasmas; irreversible Koagtflate sind g~nz salt gelb gef/trbt, w/ihrend die hellen Rgume zwischen Koagulat und Membran nur sehr bla.sse violette F/irbung aufweisen. Je sttirker das Hyaloplasma entfiirbt wird, um so st/irker gebt der Farbstoff in das Granuloplasma.

    Vo~l ciner Konzentration yon ungef~hr O,16-M (auf das Gesamtvolurn bezogen) bewirkt das Caleiumchlorid auch einen Farbenumsch lag des Brom- k reso lpurpurs im Zc l lkern. Der Ze l lkern n immt gr i ine Farbe arl. ]Die griine Farbe resultier~ jedenfalls aus einer l~*ber]agerung einer nicht aus- geglichenen gelben und einer blauvioletten F~irbung. Je h6her man dann mit der CaCl~-Konzentration hinaufgeht, um so mehr tritt (tie gelbe F'arbung hervor. Bei 0,25-M CaCl2-Konzentration erschienen die Ze l lkerne gelb. Eine r/ium- liche Sonderung der violet.ten und der gelben F/irbung der Zellkerne ist nieht zu beobachten. ]Die gelbe F/irbung erscheint ebenso wie die violette des nor- malen Amoebenkernes und ebenso wie die Gelbfgrbung der ausgewa.schenen Kerne des Zellbreiverguehes v6llig gleichm~Big im ganzen KErn.

    Von den CaCl~ -~ BCP-Versuehen mSehten wir zwei 1)unkte mit besonderem Nachdruck hervorheben. 1. ])ie gelbe F/irbung des Granuh)plasmas erscheint

  • ])as Problem der Reaktion des Protoplasmas 397

    sofort. Im Augenblick der Injektion ist aueh schon die gelbe Insel des Granulo- plasmas zu sehen, aueh wenn dieses nicht koaguliert wird. 2. Zieht man die Neubild~mg einer S~iure in Erw/igung, so st6Bt man auf die Schwierigkeit, dab die meisten S/~uren inklusive Milchs/~ure bis zu der recht hohen Konzentration, die auf S. 389 angegeben wurde, die normale BCP-Farbe des Amoebenplasmas nicht s Es mfiBte sieh also schon um eine momentanc Bildung von einer sehr betr.~ehtlichen S/r handeln. 3. So etwas wie eine Diffusion der sauren Reaktion vom Gramfloplasma in die Umgebung ist niemals zu beobachten. Die saure Reaktion yon der Gr6~enordnung des gelben BCP- Farbtones ist aufs Deutlichste an bestimmte Substanzen im Protoplasma gebunden. Sowohl in dem noeh lebenden als auch in dem koagulierten Proto- plasma handelt es sich um ein Hervortreten einer sauren Reaktion des Granulo- plasmakolloides, die auf diese beschr~nkt bleibt, so dab ffir die ganze Analyse des Vorgangs die Frage von entscheidender Bedeutung ist, was fiir e ine Re- akt ion d iese Ko l lo ide vorher gehabt haben, d. h. normalerwe ise haben. Spek erkl~rt die Calciumwirktmg so, dub das Salz die Adsorption des Indikators im Hyaloplasma riiekg/mgig macht, and dab dann ,,der Konkurrent", das Granuloplasma den Farbstoff an sich reiBt, wo er dann die Eigenreaktion der Granuloplasmako]loide anzeigt.

    Dieselbe Erkl/irung seheint ihm aueh auf die CO2-Wirkung iibertragbar zu sein.

    In schw~cheren Konzentrationen unter 0,03-M CaCle wird die Gelbf/~rbung des Granuloplasmas kaum crkennbar blab und tr itt schlieBlich gar nicht mehr auf. In sts Konzentrationen wird die Gelbf~trbung auch erhalten, wcnn eine alkalische, tiefblauviolette Mischung des Salzes mit dem Indikator BCP verwendet wird. In anges~iuerten Gemischen von CaCl 2 -v BCP erscheint das Hyaloplasma noch blasser violett. Sonst kein wesentlichcr Unterschied gegen- iiber neutralen Gemischen.

    Injektionen von Ch lorpheno l ro t 1% gemischt mit 0,0625 bis 0,125-M CaCI 2 ergaben gesultate, weiehe prinzipieI1 mit denen mit BCP vollkommen iibereinstimmen. Das Granuloplasma nimmt eine orangegelbe F~rbung an, w/~hrend das Hyaloplasma.karminrot ist. Die Kerne fSrben sich in diesen CaC12- Konzentrationen karminrot und betmlten die Farbe lange. Die orangegelbe F/~rbung des Granuloplasmas ist aueh bier verganglich.

    Mit Methy l ro t 0,4 and 0,5 % erh/flt man, wenn es zusammen mit CaCI2 injiziert wird bei Gesamtkonzentrationen des CaC12 yon 0,0625 bis 0,166-M eine verschwommene rote Anf/~rbung des Protoplasmas im Bezirk des Granuloplasmas und eine ]~otf/irbung des Kernes, wenn die LSsung direkt gegen ihn injiziert wird. l)as Hyaloplasma bleibt orange. Wenn die Injektion yore Kern entfernt erfolgt, bleibt er auch orange. Die rote Anf/~rbung ist sehr verg~tnglieh und die ganze Farbe pflegt sehr raseh zu verschwinden. Der Umschlagspunkt des Methylrots liegt bekanntlich g~mz nahe bci dem des Chlorphenolrots.

    In ~bereinstimmung mit dem Farbton des CPR und MR sehl~gt Brom- k reso lgr~n 1% mit den gleichen CaC12-L6sungen gemischt, die wir mit CPR

  • 398 Spek und Chambers

    ausprobierten, so|oft in B lau, also den Farbton auf der alkalischen Seite, urn. Kern und Plasma werden b/an. Das Oranuloplasma wird also nicht griin oder gar gelb. Sclbst wenn mall anges'~uerte blaugrfinc RCG-Liisung -L OaCl 2 0, l -M oder gar gelbe LSsungen injiziert, schlagen sic in der Zelle in Blau urn.

    l+rompheno lb lau + CaOL. beh~lt (lie blauviolettc Farbe anch be| Jn- jektion stark koagulierend wirkender Gcmische wie 0,5-M Ca()lm -!- gleiche 51enge9 BPB 1 o/,,o. (~rannloplasma und Hyaloplasma f/it'ben sieh be|de blau- violett.

    Wiv sch/itzen nach a.llenl die Aeidit~t, welche im Oramdoplasma nach ~ter Ca(~12-1njektion bervortritt auf etwa p]-I := 5,0. Viel tiefer kann der t)H-Wert nicht liegen, derm (lann mii[~ten ja CI)R gelb ~lrJ(I 3'IR rosa Farbe zei~e~l. Es t ritt hicr also dasselbe pH znm Vorschein, welches wit 1)el den Zellbreivevsuchen am ansgew~tsehenen Oeri~nsel erbielten. Die Wcrte, zu dencn gez nik off un(1 P o 11 a c k (1928) fiir die naeh (ler OaCl 2- hljektion her~'ortvctende Act(titbit gclangten ( l )H - 4,0- r4,(i), licgen je(lenfalls zu tie|. Zu dieser Sch/~tzung sind die Autoren wohl nur d~dureh gelangt, dal3 sie den fiir (tiesen pfi-Bereieh entscheidenden Indikator ]3CG nieht verwcndet haben.

    Von den Versuchcn mit Calciumehlorid und den hSher nmschlagenden Indikatoren strict besonders (lie mit P i~enol rot iutef'essant, l{emerkenswert |st (lavan, dal~ (let sofortige Umsehlag scharl~/chroter LSs(mgeH zu Gelb aueh schon be| recht niederen Konzentrationen yon CaCI 2 (0,0125 und 0,025-M) eintritt, in denen die Tiere am Leben bleiben, nnd dalt (tie Gelbf/irbung mehr diffusen (~harakter hat als dic in BCP odor OPR. Untcvsueht man allerdings ei~le grSf3ere Anzahl gut beweglichev gelber |)henoh'ot-Ca(~12-Tiere nach voH- zogener Absehniirtmg sorgf/iltig be| st~,rkerer Vel~ri~I3crnng, so finder man |miner wie(lcr Details, (lie zcigcn, d~i~ anch bier eine Ten(tenz znv Entf/irbung des Hyalo- plasmas besteht, dali das Hyaloplasma ~uch hier fast v61lig farblos werden kann, wi~hrend (lann din .u des Granuloplasmas eine blasse zitroncngelbe F~rbung annimnlt: oder (latin kann nlan be| Tieren, deren Hyalopl,~sma aucb tioeh etwas gef/irbt |st, detttli(,h erkennen, (tar3 zwischen Grantlloplasma und HyaIoplasma ein Farbunterse|lied besteht der Art, (lab (l~ts Hyalopl~sma rStlicher |st. Aber wenigstens voriibergehend scheint doch auch im ttyalopiasma eitie schwaehe VcrschiebuHg des Farbtons bis zu einem Gelb stattzufinden, das einem I)H yon 6,8---7,0 entspvicht. Allgerneinere Schbtl~folgerungen k6m~en wiv (taraus vor- l'/iufig nicht ziehen, well wit noch nicht wissen, ob nicht atmh dic hyalinen Pl,~sma- sul)st~nzen bin Gemisch yon Substanzen verschicdencr Reaktion sin(l, was wit auf Grund yon ~]lgcmeinen (iTberlegungen (s. S. 380) sehon fiir wahrscheinlich gefunden haben. Es set noch erwKhnt, dab atteh (licse Ca-Wirkung aueh mit alkalischen (roten) CaCl.z-Phcnolrotgemischen erhalten wird. Sic schlagen stets in Gclb urn.

    Injcktionen yon Gemischen yon CaCI 2 mit K l 'csolvot ergaben keine bemerkenswerten Einzelheitcn. Dal~ eine rote LSsung in Gelb umschl/s konnte nicht an(tcrs erwartet werden. Die F'/irbung |st wie die ohne CaC]~ 1)laI~ und diffus. Ob der Kern auch gclblich gef/irbt |st, |st zweifelhaft.

  • I)as Problem der Reaktion des Protopla~mas 399

    b) Versuche mi t Magnes iumch lor id

    Auch Magnesiumchlorid hat einen gewissen EinfluB ~mf die F/irbung des Amoebcnplasnlas mit Indikatoren, der in manchen Punkten iibereinstimmt mit dem des Calciumchlorids. Wir haben daher auch mit ihm Scrienversuchc angestellt, in dcnen es gcmiseht mit CPR, BCP oder PR in Konzentrationen variierend yon 0,0312 bis zu 0,5-M injiziert wurde. Die gr6Bte :~hnlichkcit mit dcr entsprechenden Wirkung des CaCl2 hat noch der EinfluB des MgC12 auf (tie Phenolrotfiirbung. Auch MgCI,, ruft stets eine zicmlioh diffuse Gelb- fiirbung horror. ])as pH des Hyaloplasmas erscheint bis zu ungef~hr 6,8 ver- schobcn. Bei all diesen Beobachtungcn iibcr eine Verschiebung des PR-Farb- tones nach der saurcn Seitc dutch irgendeine Salzwirkung muB bedacht wcrden, dal~ auch beim Absterben der Amocben eine leichte Verschiebung dcr Indikatorenfarbe im Zellkbrper nach der sauren Seite erfolgt, dic in PI~ am raschest~,n eintritt. Man mul~ also darauf ausgehen, die Konzentration zu finden, in der die Tiere am Leben bleiben und trotzdem gelbe PR-Farbc zeigen. Lebcndc gelbe PI~ -- Ca-Cl.,-Tiere hat Spck in zahlreichen Versuchen erhalten. Bei MgC12 haben wir fiber dicsen l)unkt noch nicht genfigend Daten gesammelt. Mit Bronlkresolpurpur und ('hlorphcnolrot ist cs sehr viol schwercr durch gleichzeitigc Injcktion yon MgC12 oin Hervortretcn saurer Farbt6ne herl)eizufiihren. Gerade auch Injektioncn yon h6hercr Konzcntration, von 0,25 und 0,5-M batten in dieser Bezielmng cin ganz negatives Ergebnis. Ja es wird sogar die Anf'/irbung alkalischer Substanzen durch (las Salz, wie es scheint, noch verst/irkt. So wi,'d die B lauv io le t t f i t rbung der Ze l l kerne in BCP und die Karminrotfiirl)ung derselben in C])I{ naeh Injektion yon Magnesium- chlorid augenblicklich viel intensiver. Schlie|31ich gelang es uns dann bei In- jektionen yon relativ sehwachen L6sungen von Magncsiumchlorid und zwar 0,()31,, 0,0625 und 0 125-M mit BCP 1 o/ die tvpische Gelbfitrbung des Granule- plasmas im violetten Hyaloplasma zu bcobachten. Sic war aber auch hier nur blab und oft nur in (ler [;'mgebung der Injektion ausgebildet. Von einer Weitcr- verfolgung dcr Expcrintente wurde (lann abgeschcn, da MgCl~ geradc auf diescn Indikator schon in relaiiv gcringen Konzentrationen eincn spezifischen ver- ~ndcrnden Einflu~ hat, ([er in eincr langsamen Braungelbfi~rbung bestcht. - - Erw/ihnt sei noch, dab MgC12 in Konzentrationen fiber 0,125-M eine cigentiim- liche Vcr/inderung der Kcrnc der injizierten Amoel)en hcrvorruft. Die Konturen der Granulen werden unsichtbar und die ganzen Kcrne werden glasklar und scheinen etwas anzuschwellen. Nach ciniger Zeit erscheint dic normale Struktur und Form wieder.

    e) Versuehe mi t Z ink- , Mangan- und Cersa lzcn

    Allen Salzcn mit zwei- und dreiwertigen Kationen kommt im wesentlichen die gleiche Wirkung auf das Amocbcnplasma und sein Vcrhalten gcgen die [ndikatoren zu. So wie Calciumchlorid rufen sie eine Koagulation des Granule- plasmas hervor. Das Hyaloplasma, welches sich zuerst im alkalischen Farbton

  • 400 Spek und Chambors

    anfarbt, wird rasch entf'~rbt und in dem MaSe, als es die Farbe verliert, reiBt das Granuloplasma diese an sich und fiirbt sich im tiefsauren Farbton an. Da die Anf~rbung (ler Plasmasuhstanzen bei Gegenwart dieser Salze z. T. viel intensiver ist als im CaCl~, lassen sich manche Einzelheiten besser studieren.

    Natiirlich muB man die (lurch die hydrolytische Spaltung der Salze be- dingtc saute Reaktiort ihrer L6sungen ausschalten. Bei dcn yon uns vcrwendeten Salzen ZnS04, MnCl 2 und Ce(NOa).~ ist (lurch tropfenweisen Zusatz yon NaOH eine Verminderung der Aciditi~t bis zur violetten F/irhung yon BCP m6glich, ohne (ta[3 einc Ausffillung (ier Hydroxyde o(ler des Farbstoffes crfolgt. Diese geniigtc fiir unsere Zwecke. Von allen Salzen wurden solche LSsungen ver- wendet.

    Dic Versuchc mit Z inksu l fa t mit einem Indikator sin(1 sehr eindrucksvoll. ]njiziert man z. B. eine violette Mischung yon gleichen Teilen yon 0,05-M ZnS04 + 1% BCP, so erscheint augenblicklich um die Pipette hcrum im Granuloplasma ein kbrnigkoagulierter tiefgelber Hof. Das Hyaloplasma zeigt im ersten Augen- blick zicmlich intensive violet~ F'~rbung, (tie jcdoch rasch blasser wird. In glcichcm Schritt nimmt (lie gelbe Farbe des Koagulates zu. Nach einigen Minuten entf~rbt sich aher auch das gelbe Koagulat fast vollst/in(lig. Die Kerne f/~rben sich braungelb. Die Amocben werden getStct.

    In ganz analogcr Weisc f'~rbt sich bei einer lnjektion eines Gemisches vo~ Zinksulfat 0,05-M mit Chlorphenolrot 1 '/o das koagulicrte Granuloplasma orange, das umgebende Hyaloplasma rosa. In dem MaBe als die Rosaf~rbung des Hyaloplasmas blasser wird, nimmt die lntensit/it (ter GranulopIasmaf~rbung zu. Die Kcrne f/irben sich in CPR orange. Dic Gelbf'~rbung in BCP und die Or~mgefarbung in CPR ist im Plasma aufs Sch'hrfste auf (lie koagulierte Plasma- masse heschr/~nkt.

    Injiziert man im BCP-Versuch, nachdem auch (las koaguliertc Plasma mehr oder weuiger wiedcr eutf/~rbt ist, eirmn neuen Tropfen des ZnSO 4 -I BCP- Gemisches in die tote Zelle, so nimmt das koagulierte Plasma nochmals vor- fibergehend eine blasse gelbe F/~rbung an, uad der Versuch kann evtl. noch ein drittes Mal wiederholt werden. Ahcr die Anf~rbung des Grarmloplasmas gelingt fortschreiten(] immer schwercr. Geht man yon (]er Vorstcllung aus, dab die (]elbfiirhung des Koagulats (lurch eine Neubil(tung yon Siiurc (lurch einc Reaktion zwischen dem Salz und den Plasmastoffcn hervorgerufen wird, k6nnte man glauben, (lab die Gelbftirbung bei Wie(]erholung der Injektion immer schwi~cher wit(t, well die mit dem ZnS() 4 reagierenden Plasmakolloide cben allm~hlich ,,aufgebraucht" werden. Dic Dinge liegeu abcr nicht etwa so, daJ] sich das Granuloplasma ,,nach Ablauf der Reaktion" jetzt im neutralen (also in diesem Fall im violetten) Farbton anf'~rbt, sondern es wird allm/~hlich i iberhaupt un f~rbbar und er~'~cheint nach dem Auswaschen der Farbc fast vSllig farblos: und dieses Farbloswerden allein erkl~irt schon die ganzc Erscheinung.

    Bci (let starken Wirkung des ZnSO 4 in den angegehenen Konzentrationen ist es /iberraschend, dab mit einer Konzentration yon 0,0125-M (auf das Ge- samtvolum berechnct) die untere Grenze fiir das Hervortreten des saurcn Farb-

  • Das Problem der P~eaktion des Protopla~mas 401

    tones im Granuloplasma sehon erreicht ist. Bei schw/~cheren ZnSQ-Konzen- tr~tionen geben CPR und BCP sehon wieder die Farbreakt ionen wie in reiner L6sung.

    DiG Versuche mit Mangan- und Cer-Salzen boten nichts prinzipiell Neues. In vielen Punkten sind sic blo{~ clue Wiederholung der ZnSOa-Befunde. Nur dig quantitative Seite stimmt bei den versehiedenen Salzen nicht ganz tiberein. DiG beste Konzentration ftir den MnClz-Versuch mit BC1 ) ist MnCI~ 0,1 -M -- BCP 1% also eine Gesamtk(mzentration yon 0,05-Y[ MnC1 v Bei Injektion dieser Mischung wird das Granuloplasma gelb, das t{yalo- plasma violett und indem diese Farbung des Hyaloplasmas auch hier wieder blasser wird, reil3t das Granuloplasma (tit 1%rbe um so starker an sich und wird tieI gelb. Der Kern blieb violett. Die Bewegung h6rtc auf. Mit MnCI, 0.025-M (auf das Gesamtvolum bezogen) ist dig untere Grenze schon erreieht. Aueh mit Phenolrot erhalt man nut his zu dieser Grenze Umsehlag zu Gelb. Diese gelbe Phcnolrotfarbung ist aueh hier mehr diffus, Nach lnjektion yon 0,0125-M Ml~.(~l 2 ul~d nach klei~mn Injektionen yon starkeren L6sungen bleiben die Tiere am Leben.

    Auch eine (lurch tropfenweisen Zusatz yon NaOH violett gemachte Mischung yon ungefahr 0,05-M Ce(NOa)a (Konzentration der IA~sung war nieht mehr genau) mit BCP gab eine nicht allzutiefe Gelbfarbung des koagulierten Granuloplasmas bei blasser grauvi~let ter Farbung des Hyaloplasmas. Kurz, es sieht so aus, als ob jede Salz-Koagulation im Am,ebcn- plasma ttberhaupt, vielleieht dutch eine strukturelle Sonderung der verschiedenen Substanz(,n des I)rotoplasmas im BCP und CPR eine differente F~irbung der beiden Haupt.komponel~ten herw~rtreten I/tBt-, wobei das koagulierbare Granulopl~tsma einen sauren Farbton annimmt, wabrend alas Kyaioplasma, solange es die Farbe iiberhaupt behalt, den normalen Farbt(m zeigt.

    d) Versuche mi t L i th ium- , Nat r ium- und KMiumsa lzen

    Auch die Wirkung der Salze mit einwertigem Kat ion ist im wesentlichen immer wieder die gleiche. Sie rufen, wie sehon C 'hambers (1900) gezeigt hat, auch in sehr konzentr ierten LSsungen keine Koagulat ion im Amoebenplasma hervor. Die Granulen tSsen sich auseinander und (tie Kr ista l le sinken im Zell- k6rper zu Boden. D ie Sa lze verandern das F /~rbungsergebn is mi t den Ind ikatoren n ieht . Dies ergaben Injekt ionen yon violetten Misehungen yon gleichen Teilen einer 0,5-M LiC1- oder NaCI- oder KC1-L6sung mit 1 ~ BCP. Ebenso In jekt ionen yon solchen Misehungen yon NaC1 0,5-M q- 0,2 % PR. Der BCP-Farbton bleibt violett. Die Kerne f~trbten sich auch violett, l)er PR-Farbton war das normale ziegelrot, selbst wenn anges~uerte Gemisehe ver- wendet wurden. Auch nach In jekt ion von Na2SO 4 0,25-M + 0,2 ~ PR erschien der normale PR-Ton. Die Tiere gehen aber rasch ein und werden dann gelb. Auch In jekt ionen yon sehw/icheren L6sungen yon KSCN (0, l -M) batten keinen Einflull auf die BCP-F/~rbung.

    e) Vcrsuche mi t AmmoniumsMzen

    Zum Schlusse dieses Kapi te ls mSchten wir noch tiber einige Versuche mit Ammoniumsalzen berichten, die eine Erseheinung zu zeigen seheinen, der wir bisher noch nicht begcgnet sind. In j iz iert man n/~mlich Gemische yon 0,2 oder 0,4-M NH 4 9 C1 oder (NH4)~SO 4 PR 1 ~ so erh/~lt man in der Zelle zun/~chst

    Protoplasma. XX 26

  • 402 Spek und Chambers

    immer den normalen ziegeh'oten Phenolrotton. Reine L6sungen tier betr. Ammoniumsalze sind stets sauer. Setzt man diesen das Phenolrot zu, so wird die Misehung tiefge]b. Abet aueh diese saueren Misehungen seh]agen in der Zelle stets zum normalen Ziegelrot urn. I~berraschenderweise erfolgt dann abet nach einigen Minuten stets ein langsamer Umsehlag nach Gelb. Fiir die schw/~cheren NHI. C1-LSsungen wurde unzweifelhaft festgestellt, da ~3 die gelben Tiere leben und langsame Bewegungen ausfiihren. Die Erscheinung ist also etwas anderes als die in abgestorbenen Amoeben hervortretende sauere Reaktion. Im Gegensatz zu der Gelbfgrbung der Amoeben in Caieiumehiorid + Phenolrot, die auch be/ lnjektion yon a]kalisehen CaC12- {- PR-Oemisehen er/olgt, tritt die nachtriigliche Gelbfgrbung dermi t Ammoniumsalzcn :- PR injizierten Amoeben n icht ein, wenn ein bis zur Rotfgrbung alkalisch gemachtes Gemisch injiziert wird. Spek hat die Erklgrung zu gcben versucht, dab zuerst cinc Anfgrbung des alkalischen I-Iya]oplasmas erfolgt, und dab dann einfach diese Anf/irbung dureh das Sa.lz riickg/i.ngig gemacht wird, dab dcr Farbstoff mit andern Worten in das Dis- persionsmittel zwischen den Kolh)idtcilchen zuriicktritt, das sauer ist, wenn eine sauere, un(1 alkaliseh ist, wenn eine alkalische LSsung injiziert war, so dab dann demcntsprechend eine Gclbf/irbung nut nach lnjektion yon einer saueren Farbl6sung erwartet werden kann. Diesc Erkl/irung stiitzt sich auch auf die Beob- acbtung, dab Vitalfs mit penetrierenden Farbstoffen sowohl bei Amoeben, als aueh bei anderen gellen dutch gusatz yon kleinen Mengen ,,-on Ammonium- salzen in kfirzester Zeit wieder v611ig rfickggngig gemacht werden k6nnen.

    4. Probleme, welche sich aus den u der Amoeben ergeben

    Einige zel]p~ysio]ogiseh interessante Daten, welehe wir an vitalgef/irbten Amoeben gesammelt batten, wurden sehon oben erw/ihnt, so die Erseheinung, daft die vitalf~trbenden Indikatoren die Grundmasse des Plasmas leider so gut wie gar nieht anfgrben, dt~l~ sio bei Beriihrung mit dem Plasma ausgefgllt werden, wenn man sie zu injizieren sueht, dal] sie in hoher Konzentration in Vakuolen gespeiehert werden und bisweilen den Zellkern blab anfarben. Wir mSehten das Bild der VitMfS.rb~mg bier noeh e~was erg~nzen, u,e~l sich daraus do(;h aoefl einige Schlul3folgerungen fiir die behandelten Fragen ergeben.

    Spek fiihrte Vitalf~rbungen mit Neut ra l ro t , g r i l l antv i ta l ro t , B r i l l antkresy lv io le t t und Kresy leehtv io le t t aus. Alle Farben stammten yon gr i ib le r ( l , ipzig). Sie wurden stets nur in minimalen Mengen dem Medium zugefiigt, so dab dieses eine kaum erkennbare Farbe annahm. Am besten ist im aligemeinen ein gusatz yon 1 Tropfen einer */= % L6sung zu 20 Gem Kultur- medium. Naeh einigen Stunden ist in allen Farben dee ganze Zellk6rper der Amoeben erffillt mit tiefgef/irbten grofien Vakuolen. Stets sind die Nahrungs- vakuolen in allen Stadien tief gefgrbt. Halbverdaute Nahrungsbroeken in neuen Nahrungsvakuolen zeigen stets saueren Farbton der Indikatoren. Die diekliehen, tropfenartigen Substanzen in den/ilteren Nahrungsvakuden nnd die lq/~ssigkeit der Vakuolen drum herum sind alkalisch. Aul]erdem sieht man im Plasma, wie oben erwghnt wurde, zahlreiche gefgrbte Flfissigkeitsvakuolen ohae festen

  • Das Problem der Reaktion des Protoplasmas 403

    Inhalt. Auch sie zeigen alkalisehen Farbton, so dab sie sieh in den/~lteren Stadien der Vitalfi~rbung von den Nahrungsvakuolen wenig abheben. Es handclt sieh aber zweifellos um zwei ganz verschiedene Vakuolentypen.

    Dies ergibt sieh schon aus der genaueren Verfolgung der Etappen einer Vitalfi~rbung. Nehmen wir als Beispiel die ]3rillantvitalrotf/irbung: Sehon nach 5--10 Minuten erfolgt, auch wenn wir ganz schwache FarblSsungen verwenden, eine blasse Anfitrbung aller 2qahrungsvakuolen. Ihr fester InhMt ist bei frisehen Vakuolen rosa, be i ~lteren gelbliehrot. Ihre Fliissigkeit ist gelbrot. Zuerst ist aul]er den Nahrungsvakuolen nichts welter gefitrbt. Dann erscheinen (meist nieht friiher als nach etwa 25 Minuten) iiberall im Plasma zahlreiche sehr kleine Vakuolen, die eine gelbrote Flfissigkeit enthalten. In einigen liegt ein KSrnehen. An ihrer Stelle sind nach einigen Stunden zahlreiehe grSBere VakuoIen mit etwas intensiver, aber im g]eiehen Farbton gefarbtem fliissigem Inhalt. Jedenfalls sind diese aus den kleinen Vakuolen dureh Vereinigung oder An~chwellen der- selben entstanden. Offenbar werden Farbstoffe, welche in gelSster Form in das Amoebenplasma gebracht werden, unter allen Umst/~nden und ganz gleich, ob es sich um sauere oder basische Farbstoffe handelt, in ganz kurzer Zeit in der Art entmiseht, dab der weitaus gr6Bte Teil des Farbstoffes und eine alkalisehe Substanz in einer tiefgefs Vakuole separiert werden, w&hrend das iibrige Plasma so gut wie farblos wird. Als Beispiele for basische Farbstoffe, welehe in dieser Weise zur Ausseheidung gelangen, nennen wir Neutralrot, Brillant- kresylviolett und Kresyleehtviolett, als Beispie] fiir sauere, die sich ganz ebenso verhalten, Brillantvitalrot, Bromkresylpurpur und Phenolrot. Sind auBer den ,,Granulen" aueh gr6Bere w/~Brige B1/ischen in der Amoebe vorhanden, geht in sie nichts vom Farbstoff hinein. Befinden sich zwei Farbstoffe auf einmal in tier Zelle, so werden sie, soweit untersucht, wie schon auf S. 382 erw/~hnt wurde, getrennt in Vakuolen ausgeschieden.

    Dieselben Farbstoife, welche nun bei den Vitalf/irbungen so leieht in die Amoeben eindringen, werden, wenn sie in die Amoeben injiziert werden, bei Beriihrung mit dem Plasma ausgef/~llt. Die Erscheinung ist im wesentlichen schon yon Chambers (1927) beschrieben worden. Erg/~nzend haben wir sie jetzt auch ftir die 1%igen L6sungen yon Brillantvitalrot, Brillantkresylviolett und Kresylechtviolett festgestellt, wobei wir wieder hervorheben, daB Brillant- vitalrot ein saurer, die tibrigen basische Farbstoffe sind. Die Ausf's erfolgt auch, wenn die Farbl6sungen dureh Zusatz yon 0,007- N Salzsgure sauer gemaeht werden. Der Unterschied ist blol] der, dab die Farbstoffe aus der sauren LSsung in Form eines ~uBerst intensiv gef~rbten dichten kleinen Klumpens vor der Pipettenm/indung ausgeschieden werden, w/ihrend der /ibrige Teil der Zelle am Leben bleibt und kr/iftig strSmt. Bei Injektion der neutralen LSsung wird der Farbstoff yore viskos bleibenden Plasma stark adsorbiert und bildet mit ihm eine schmierige starkgef~rbte Masse, die die Pipette sofort verstopft, so daB wirkliche Injektionen nur gelegentlich gelingen: Setzt man in 0,05-M NaC1- LSsung gewasehene Amoeben in 0,2 %ige LSsungen yon Brillantvitalrot, und reil~t sie mit seharfen Nadeln irgendwo auf, so erscheint im Augenblick um die ganze Anstichstelle eine Wolke von tiefrotgef/~rbten in Brownseher Molekular-

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  • 404 Spek und Chambers

    bewegung tanzender K6rnchen, die sich aber wieder aufl6sen k6nnen, wenn nicht neues Plasma nachflieiltl).

    Was die Natur der Ausscheidung des Farbstoffes ist, ist schwer zu sagen. Eine Alkalinitiit des Plasmas yon pH = 7,3 k6nnte eventuell ausreichen, eine langsame Ausscheidung der Farbstoffe herbeizufiihren. Zur sofortigen Aus- scheidung miissen wohl noch andere Faktoren hinzukommen

    Es fragt sich nun, weshalb (tie Farbstoffe im Plasma nicht ausgeschieden werden, wenn sic yon au~en eindringen. Die Annahme, dab sie ja wohl nur in sehr kleiner Menge in die Zelle gelangen, (tie unter der L6slichkeits- bezw. Aus- scheidungsgrenze liegt, ist offensichtlich falsch oder doch sehr fraglich ; denn wenn man vitalgefiirbte Amoeben zelTeil3t, kommen m~ssenhafte Farbkristalle um die gauze Amoebe herum im Kulturmedium (Wasser ohne Farbstoff) zur Ausscheidung. Wenn man in vitalgefSrbte Amoeben gewisse Salze injiziert, so erscheinen bald iiberall im Plasm~ Farbkristalle. Spek beobachtete das z. B. na(th Injektion yon 0,1 -M KJ-L6sungen in Amoeben, die mit Brillantvitalrot gcfitrbt waren. Dureh Versetzen in 0,05- M NH 4 9 C1-LSsung k6nnen vitalgef/irbte Amoeben in kurzer Zeit v611ig entf/irbt werden. Der ganze in den Vakuolen aufgestapelte Farbstoff wird dabei in einer Stunde oder weniger durch (tie Zelle abtransportiert, ohne ausgefiillt zu werden. Es sieht fast aus, als ob in der intakten Zelle auch die Farbstofftcilehen innerhalb gewisser Grenzen gegen eine Ausfallung (lurch entgegengesetzt geladene Teilchen oder (tie Alkalinit/~t des Protoplasmas irgendwie geschfitzt werden (Spek). Wenn wit ammhmen mtissen, dal~ Plasmuteilchen ver- schiedener gea, ktion in der lebenden Zelle gegeneinander irgendwie gesehiitzt sind, liegt es nahe, zwischeu den beiden Erscheinungen eine Beziehung zu suchen. In Puffer- oder Alkalil6suugen, welche (tie Alkalinit~t der gef~rbten Vakuolen besitzen, werden alle genannten Vitalfarbstoffe vollstitndig ausgef/tllt.

    Kurze Zusammenfassung

    Die ganze geihe der pH-Indikatoren yon C lark und Lubs yon Brom- phenolblau bis Thymolblau wurde bei Variierung der Menge und Konzentration der Farbstoffe in Amoeba dubia injiziert. Bei keinem [ndikator f/~llt der sieh in der Zelle einstellende Farbton aus der Reihe heraus derart, da/3 er mit dem bei andern Indikatoren gefundenen Werte nicht harmonieren, oder da~ sich Anzeichen ergeben wfir(ten, dull andere F~ktoren als das pH der Zellsubstanzen delt Farbton bestimmen. CPR, BCP und PR k6nuen in kleinen Mengen so injiziert werden, dal~ die Vitalit~t der Amoeben durch sic gar nicht beeintr~tchtigt wird. Die Farbstoffe bleiben aber nicht gleichmit~ig im Plasma vcrteilt, sondern werden nach einer Stunde oder sp/itcr in tiefgef/~rbten Vakuolen entmischt. Der Inhalt dieser Vakuolen hat ein pH yon mindestens 7,6. Aus dem Farbton

    1) Zwischen den K6rnchen konntc Spek wiederholt eine Gelbfarbung der Farb- lbsung fcsts~llen. Auch hiernach miiBie man eigent]ich schlici3en, dab noch irgcnd etwas im Plasma vorhandcn ist, was alkalischer ist als einem pH yon 7,3 cntspricht, denn Vitalrot wird erst bei eincm pH yon ungef/~hr 7,6 gelb.

  • Das Problem der Reaktion des Protoplasmas 405

    der diffus verteilten Indikatoren ergibt sich gleich nach der Injektion ein pH yon ca. 7,3. Dieses pH kommt dem Hyaloplasma der Amoebe zu. Das yon uns sog. Granulaplasma (z Gallerthfillen der Plasmabl~ischen) zeigte in Versuchen, in denen sicher beide Plasmakomponenten angef~rbt wurden, stets eine saurere Reaktion als das Hyaloplasma. Bei kleinen Amoeben ist eine elektive Vital- fi~rbung des Granuloplasmas mit Indikatoren mSglich. Alle zeigen saueren Farbton (pit hSchstens 6,0 wahrscheinlich tiefer).

    Auch das aus angestochenen Amoeben ausflie6ende Hyaloplasma zeigt die normale alkalische Reaktion. Das ausgeftossene Granuloplasma klumpt zusammen und nimmt, wenn das Hyaloplasma daraus herausdiffundiert ist, die Farbe auch an. Der Indikator zeigt darin stets sauere l~eaktion an (orange- gelb in CPI~).

    Ein Zerrei6en der Amoeben ruft, auch wenn es unter den heftigsten Zerr- bewegungen ausgefiihrt wird, keine erkennbare Anderung des pH der Plasma- komponenten hervor, wenn man Wasserzutritt zum ZeUbrei vermeidet. D~s Hyaloplasma bleibt alkalisch. Farbton der Indikatoren ist der gleiche wie in lebenden Zellen. Das Granuloplasma bildet im Zellbrei ein zusammenh~ngendes Gerinnsel. Werden Flocken davon aus dem Zellbrei herausgezogen und mit NaC1-LSsung ausgewaschen, so nimmt das Granuloplasma nachher auch Farbe an und zeigt einen Farbton, der einem pH yon ca~ 5,0 entspricht. Auch ausge- wasehene Zellkerne zeigen sauere Reaktion, werden z. B. orangegelb in BCP, w/~hrend sie im Zellkern drinnen und in den lebenden Amoeben BCP in blau- violetter Farbe speichern.

    Auch wenn man PR gemischt mit NaOH, oder wenn man CPR, BCP oder PR mit HC1, Milchsi~ure oder Butters~ure injiziert, stellt sich bis zu einer be- stimmten Grenzkonzentra~ion der Base und der S/~uren der normale Farbton der Indikatoren ein. Bei Injektion der genannten S/~uren und Basen bleibt die Reaktion der Plasmateilchen in dem aul~erordentlich weiten pH-Bereich von 2,5--9,0 unver/~ndert! Eine eindeutige Erkl/~rung ist noch nicht mSglich. Durch Ammoniak und Kohlens~ure kann n/~mlich der Farbton der injizierten Indikatoren in wenigen Sekunden reversibel verschoben werden.

    Salzs~ure, Butters~ure und Milchss bewirken eine Anderung der CPR- und BCP-Farbe erst von einer Konzentration an, die schon koagulierend wirkt, also in reversibler Form iiberhaupt nict~t. Koaguliert wird in der Hauptsache das Granuloplusma. Tritt Koagulation ein, so fs sich das Koagulat stark an und zwar im sauren Farbton, der ungef~hr einem pH yon 5,0 entspricht. Dem Hyaloplasma wird der Farbstoff mehr und mehr entzogen. Eine blasse F~rbung im normalen alkalischen Farbton kann ~ber vielf~ch erhalten bleiben. Ganz ~hnlich, aber in den Einzelheiten besser zu verfolgen ist das Bild bei Koagulation des Amoebenplasmas durch Salze mit zwei- oder dreiwertigen Kationen. Das koagulierte Granuloplasma reiBt die Farbe an sich und zeigt wieder den Farbton, der einem pH yon ca. 5,0 entspricht; das Hyaloplasma wird rasch entf~rbt, meist aber nicht so stark, dab man nicht erkennen k6nnte, dab es immer noch einen alkalischen Farbton hat. Bei lnjektion yon CPR oder BCP mit Salzen der erw~hnten Art l~6t sich das leicht demonstrieren. Bei PR-Injektion erleidet

  • 406 Spck und Chambers, I)as Problem der Reaktion des Protoplasmas

    auch der Farbton des Hyaloplasmas unter der Einwirkung solcher Salze eine leichte Verschiebung nach der sauren Seite, deren Wesen noch nicht ganz gekl/~rt ist. - - Untersucht wurden CaC12, MgC12, MnCl2, ZnSO 4 und Ce(NO3) 3. Die Salze wurden mit den [ndikatoren zusammen injiziert. - - Salze mit einwertigem Ka.tion, auch solchc mit zweiwertigem Anion koagulieren nicht und lassen das F/irbungs- bild unver'~ndert.

    Es wurden auch Vitalfi irbungen mit den Indikatoren Neutralrot, Bri l lant- vitalrot, Bri l lantkresylviolett und Kresylechtviolett ausgef/ihrt. Die Details dcr Fttrbung und Entf/~rbung bieten ciniges, was auf die ptt-Probleme neues Licht wirft.

    Literatur

    Chambers, Robert,: [ntraeellular hydrion eonccntrat,ion studies. 1. The relation of the environment to the pH of the protoplasm and of its inclusi